Discovery of AK-1690: A Potent and Highly Selective STAT6 PROTAC Degrader

논문 "Discovery of AK-1690: A Potent and Highly Selective STAT6 PROTAC Degrader"는 새로운 PROTAC 분자인 AK-1690을 개발하여 STAT6 단백질을 타겟으로 하여 선택적으로 분해하는 메커니즘을 연구한 내용입니다. 

연구의 진행 순서

• STAT6 리간드 디자인 및 SAR(구조-활성 관계, SAR) 연구: 연구는 기존에 알려진 STAT6 억제제를 기반으로, 다양한 화학적 modification을 통해 STAT6에 대한 binding afinity 를 높이는 새로운 리간드를 디자인하는 것에서 시작합니다. 처음에, STAT6 억제제의 modification을 통해 AK-068이 개발되었으며, 이는 STAT6에 대한 높은 binding afinity 를 가지고 있었으며, 특히 STAT5와 같은 다른 STAT 단백질에 비해 높은 선택성(selectivity)을 보였습니다​.
• PROTAC 설계: AK-068을 기반으로 Cereblon 리간드를 결합하여 STAT6을 선택적으로 분해하는 PROTAC 분자인 AK-1690을 디자인했습니다. PROTAC 기술은 단백질을 분해하는 효과를 가지기 때문에 기존의 단순 inhibitor보다 더 효과적으로 STAT6 활성을 조절할 수 있는 전략으로 선택되었습니다. 이후 다양한 연결 부위와 연결 고리 길이를 최적화하는 과정에서 AK-1690이 도출되었습니다​.
• CADD 분석: 컴퓨터 기반 약물 설계(CADD) 분석을 통해 STAT6 SH2 도메인과 AK-068의 결합 모델을 예측하고, 이를 통해 효율적인 결합을 유도하는 위치와 상호작용을 확인하였습니다. 이 분석은 STAT6 단백질의 특정 결합 부위에서의 친화도를 설명하고, 새로운 modification을 통한 SAR 연구에 기반한 최적화를 진행했습니다​​.
• 효능 및 선택성 평가: AK-1690은 다양한 세포 실험에서 STAT6을 선택적으로 분해하는 능력을 보였습니다. 특히 MV4;11 백혈병 세포주 및 L1236 호지킨 림프종 세포주에서 AK-1690은 STAT6 단백질을 매우 낮은 농도에서 효과적으로 분해하며, STAT1, STAT3, STAT5와 같은 다른 STAT 단백질에 미치는 영향은 거의 없었습니다​​.
• 단백질 분해 메커니즘 평가: HiBiT 바이오루미네선스 분석을 통해 AK-1690이 STAT6 단백질을 분해하는 메커니즘을 평가하였습니다. 이 실험을 통해 AK-1690이 Cereblon과 결합해 neddylation 과정이 필요함을 확인하였고, 이는 STAT6을 타겟으로 한 PROTAC으로서의 작용을 입증했습니다​.
• In Vivo 효능 평가: AK-1690의 In Vivo 효능은 Balb/c 마우스를 이용하여 평가되었습니다. 200 mg/kg 용량으로 AK-1690을 투여한 결과, 2시간 후부터 24시간까지 간과 폐 조직에서 STAT6 단백질의 90% 이상이 분해됨을 확인했습니다​​.

주요 데이터 및 결과 정리 (표 요약)

• STAT6 및 STAT5A/B 결합 친화도 (Ki, nM):
• AK-068: STAT6 - 6 nM, STAT5A - 1000 nM, STAT5B - 500 nM​.
• AK-1690의 STAT6 분해 효능 (DC50, nM):
• MV4;11 세포주: DC50 = 1 nM​.
• L1236 세포주: DC50 = 80 nM​.
• 미세 소체 및 혈장 안정성 (각 종별):
• 인간: 미세 소체 T1/2 > 120분, 혈장 T1/2 > 120분.
• 마우스: 미세 소체 T1/2 > 120분, 혈장 T1/2 > 120분​.
• In Vivo STAT6 분해 (간 및 폐 조직, 200 mg/kg 투여 후 STAT6 분해율):
• 간: 2시간, 6시간, 24시간 모두 >90% 분해.
• 폐: 2시간 >70%, 6시간 >90%, 24시간 >70% 분해​​.

결론 및 시사점

AK-1690은 STAT6 타겟으로 매우 강력한 선택적 분해 효과를 보이는 최초의 PROTAC입니다. 이 분자는 다양한 세포 실험과 동물 실험에서 STAT6 단백질의 효과적인 분해를 유도하며, 기존의 억제제와 비교하여 월등한 선택성과 효능을 보였습니다. 특히 STAT6이 관여하는 다양한 질병에서 중요한 연구 도구로 활용될 수 있으며, 향후 STAT6을 타겟으로 하는 신약 개발에 중요한 기여를 할 것으로 기대됩니다​​.

 

-실험데이터 분석-

 

Table 1: 신약 STAT6 리간드 디자인

 

이 테이블은 논문에서 새롭게 디자인된 STAT6 리간드들의 특징과 약리적 데이터를 요약한 내용입니다. 각 화합물의 구조적 modification 과 그에 따른 약리적 성능을 비교하여, 새로운 PROTAC 설계가 목표로 했던 STAT6의 결합과 선택성을 어떻게 최적화했는지 보여줍니다.

1. 각 화합물의 화학 구조: 테이블에는 각 리간드가 갖는 핵심 화학적 구조의 특징이 나열되어 있습니다. 예를 들어, 리간드에서 변형된 아미노산 부분, 접합부, 링 구조 등은 STAT6 단백질에 대한 Binding Affinity 와 효능에 중요한 영향을 미칩니다.
2. 결합 친화도 (Binding Affinity): 각 리간드가 STAT6에 얼마나 강하게 결합하는지를 나타내는 데이터를 보여줍니다. 이 수치는 화합물의 효능을 판단하는 데 중요한 요소로, 더 낮은 값일수록 더 강한 결합력을 의미합니다. 예를 들어, 테이블에서 보이는 IC50 값이 낮을수록 STAT6에 대한 더 높은 선택적 결합을 나타냅니다.
3. 선택성 (Selectivity): 선택성 데이터는 리간드가 다른 STAT 단백질 (예: STAT3, STAT5 등)보다 STAT6에 얼마나 더 특이적으로 결합하는지를 평가합니다. 선택성이 높은 화합물일수록, 타겟 단백질인 STAT6에만 선택적으로 작용하며 부작용을 줄일 가능성이 높습니다.

이 테이블은 STAT6을 표적으로 하는 새로운 PROTAC 리간드들이 기존 약물과 비교했을 때 더 나은 효능과 선택성을 가짐을 확인하였으며, 각 구조의 modification 이 어떻게 Binding Affinity 와 selectivity에 영향을 미쳤는지를 보여줍니다.

 

 

 

Figure 1: STAT6과 결합한 화합물 2의 예측 결합 모델

 

그림 1에서는 화합물 2가 STAT6  SH2 도메인과 어떻게 결합하는지를 이해하기 위해 모델링한 두 가지 결합 모델을 보여줍니다. 이 두 모델은 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린 부분의 방향에 따라 차이가 있습니다:

1. 결합 모델 1 (청록색):
   • 테트라히드로이소퀴놀린 부분이 Gln590과 Arg605 사이의 틈에 위치합니다.
   • 이 모델의 결합 에너지는 −6.0 kcal/mol입니다.
2. 결합 모델 2 (녹색):
   • 같은 부분이 Ile573, Phe592, Leu609, Leu612로 형성된 hydrophobic pocket(소수성 주머니)에 위치합니다.
   • 이 모델의 결합 에너지는 −4.3 kcal/mol로 다소 낮습니다.

두 모델 모두에서 벤조티오펜 기반 인산화 티로신 유도체는 Lys480, Arg562, Arg510으로 구성된 양전하 주머니에 결합합니다. 이러한 상호작용은 연구진이 이전에 연구했던 STAT3와 STAT5의 리간드 결합 구조와 유사합니다.

 

추가로:

• Ser564와 Arg562가 di-F 그룹과 수소 결합을 형성합니다.
• 벤조티오펜 그룹은 Pro591과 근접하게 있으며, t-부틸 그룹은 용매에 노출되지만 Glu587과 접촉하고 있습니다.

이 결합 모델들은 구조-활성 관계(SAR) 연구에서 추가적인 최적화를 위해 중요한 가이드를 제공했습니다​​.

 

 

Table 2: C-말단 amide  결합과 인산화 티로신 유도체가 STAT6 결합 친화도에 미치는 영향

 

테이블 2는 화합물의 C-말단 amide 결합과 인산화 티로신 유도체(phosphotyrosine mimetics)가  STAT6 결합에 미치는 영향을 분석한 데이터를 제공합니다. 이를 통해 리간드의 구조적 변형이 결합 친화도에 어떻게 영향을 미치는지 확인할 수 있습니다.

1. C-말단 amide  결합의 중요성:
   • 연구진은 AK-068의 C-말단에 위치한 amide 결합을 변형해 결합 친화도에 미치는 영향을 평가했습니다.
   • 이를 위해 amide  결합을 메틸렌 결합으로 바꾼 화합물 25를 합성한 결과, STAT6에 대한 Ki 값이 2.0 μM으로 나타나 AK-068보다 300배 낮은 결합력을 보였습니다. 이로 인해 amide  결합이 높은 결합 친화도를 유지하는 데 매우 중요하다는 사실을 확인했습니다.
2. 인산화 티로신 유도체의 변형:
   • 연구진은 AK-068에서 사용한 벤조티오펜 기반 인산화 티로신 유도체를 나프탈렌 기반 유도체로 변경한 화합물 26과 27을 설계했습니다.
   • 화합물 26은 (R)-3-모르폴린 구조를 갖고 있으며, Ki = 660 nM으로 AK-068보다 100배 낮은 결합 친화도를 보였습니다.
   • 화합물 27은 (S)-3-모르폴린 구조를 갖고 있으며, Ki = 3.0 μM으로 해당 아날로그 9에 비해 4배 낮은 친화도를 보였습니다.

이 데이터를 통해 C-말단 아마이드 결합과 인산화 티로신 유도체의 구조적 변화가 STAT6과의 결합 친화도에 매우 중요한 역할을 한다는 결론을 얻었습니다.

 

 

Table 3 설명 및 분석:

 

테이블 3은 tert-Butyl 그룹의 치환이 STAT6와 STAT5A/B에 대한 결합 친화도에 미치는 영향을 설명하고 있습니다.

AK-068의 tert-Butyl 그룹은 STAT6 단백질과의 결합에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며, 이 그룹을 대체하는 다양한 알리파틱 또는 방향족 소수성 그룹들이 STAT6에 대한 결합에 어떤 영향을 미치는지 분석한 결과가 나와 있습니다.

 

주요 데이터 확인:

1. tert-Butyl 그룹 치환: 여러 가지 치환 그룹들이 AK-068에 추가되었고, 이들 화합물들의 STAT6과의 결합 친화도를 분석한 결과가 제시되어 있습니다.
   • 28-36번 화합물들은 90-340nM의 Ki 값으로 STAT6과 잘 결합하였으나, AK-068보다는 상대적으로 덜 강한 결합력을 보였습니다.
   • 따라서, 이러한 소수성 그룹의 치환이 STAT6와의 결합에서 어느 정도의 친화도를 유지할 수는 있지만, 최적화된 구조는 AK-068의 구조임을 시사합니다.
2. 양전하 그룹 추가: tert-Butyl 그룹이 STAT6의 Glu587과 가까운 위치에 있어 양전하를 띤 그룹이 Glu587의 음전하와 상호작용할 수 있는 가능성을 고려하여 여러 양전하를 띤 치환 그룹(37-40번 화합물)이 설계되었습니다.
   • 이들 그룹은 180-450nM의 Ki 값을 기록하였지만, AK-068에 비해 30배 이상 덜 강한 결합력을 보였습니다.
   • 이는 이론상 예상되는 전기적 상호작용이 실제로 결합 친화도에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다.

결론:

• tert-Butyl 그룹은 AK-068에서 결합 친화도를 유지하는 데 중요한 역할을 하며, 소수성 그룹을 대체하거나 양전하를 가진 그룹으로 대체하는 것은 결과적으로 결합력 저하로 이어집니다.
• 따라서, tert-Butyl 그룹의 구조적 위치는 STAT6과의 상호작용에서 최적화된 상태로, 다른 치환은 이와 같은 효과를 발휘하지 못합니다.

이 표는 STAT6 결합 친화도를 최적화하는 데 있어 소수성 치환과 전하 상호작용의 중요성을 시사하며, 구조적 최적화의 필요성을 보여줍니다.

 

 

Table 4: 프로린 링 modification을 포함한 STAT6 리간드 분석

 

테이블 4는 프로린 링의 modification 이 STAT6 리간드의 결합 친화도에 미치는 영향을 보여줍니다. AK-068의 프로린 링을 modification 하여 여러 유도체를 디자인한 후, 이들이 STAT6과 어떻게 상호작용하는지를 분석한 결과가 나옵니다.

 

주요 포인트:

1. 프로린 링에서 6각형 피페리딘 링으로 modification :
   • 프로린 링을 6각형 피페리딘 링으로 modification 한 결과, 화합물 41과 42는 각각 Ki = 110 nM과 160 nM의 결합 친화도를 보였습니다.
   • 이는 AK-068에 비해 17배 낮은 결합 친화도를 나타냅니다.
2. 7각형 아제파닐 링으로 modification  :
   • 5각형 프로린 링을 7각형 아제파닐 링으로 modification 한 화합물 43과 44도 유사한 결과를 보였으며, 결합 친화도가 AK-068에 비해 낮아졌습니다.
   • 이 데이터는 링 크기 변화가 STAT6 결합에 부정적인 영향을 미친다는 사실을 보여줍니다.
3. 프로린 링에 퓨즈드 페닐 그룹 추가:
   • 프로린 링에 퓨즈드 페닐 그룹을 추가한 화합물 45와 46은 각각 33 nM과 44 nM의 Ki 값을 보였으며, 결합 친화도가 크게 개선되었습니다.
   • 이 변형은 STAT6 결합에 긍정적인 영향을 미치며, 구조적 modification 이 결합력에 미치는 효과를 입증합니다.
4. 피페리딘 링에 페닐 그룹 추가:
   • 6각형 피페리딘 링에 퓨즈드 페닐 그룹을 추가한 화합물 47과 48도 유사한 친화도를 나타내었으며, 이는 결합력이 향상된 구조임을 확인할 수 있습니다.

결론:

• 프로린 링 modification은 STAT6 결합 친화도에 큰 영향을 미칩니다. 특히, 퓨즈드 페닐 그룹을 추가하면 결합력이 크게 향상되며, 이는 새로운 리간드 설계 시 고려할 수 있는 중요한 요소입니다.
• 반면에, 링 크기의 변화는 결합력에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로, 구조적 최적화에서 중요한 변수로 작용합니다.

이 분석은 STAT6과의 결합력을 최적화하기 위한 구조적 modification 의 중요성을 시사하며, 향후 리간드 디자인에서 중요한 기준이 될 수 있습니다.

 

 

Table 5: AK-068의 프로린 링 modification을 통한 PROTAC 디자인용 테더링 부위 확보

 

Table 5는 AK-068의 프로린 링을 modification  하여 PROTAC 설계에 적합한 테더링(tethering) 부위를 찾기 위한 실험 결과를 보여줍니다. 이 테이블은 프로린 링에 다양한 치환기나 modification을 도입한 화합물들이 STAT6에 대한 결합 친화도와 STAT5A/B에 대한 선택성에 미치는 영향을 분석하고 있습니다.

 

주요 내용:

1. AK-068:
   • 이 화합물은 테더링 변형 없이 사용되었으며, STAT6에 대한 Ki 값은 6 nM, STAT5A/B에 대해서는 각각 1000 nM과 500 nM으로 나타났습니다.
   • 이는 STAT6에 대한 높은 선택성과 결합 친화도를 보여줍니다.
2. 화합물 49 (OH 치환):
   • 프로린 링에 하이드록시(OH) 치환기를 추가한 화합물로, STAT6에 대한 Ki 값은 10 nM입니다.
   • STAT5A/B에 대해서는 각각 1300 nM과 530 nM으로 결합 친화도가 약간 감소하였으나 여전히 높은 선택성을 유지했습니다.
3. 화합물 50 (OMe 치환):
   • 메톡시(OMe) 그룹으로 치환된 화합물로, STAT6에 대해 6 nM의 Ki 값을 나타내며, STAT5A/B에 대해서는 각각 1000 nM과 670 nM의 친화도를 보였습니다.
   • 이 결과는 메톡시 그룹이 결합 친화도에 거의 영향을 미치지 않음을 보여줍니다.
4. 화합물 51 (NH2 치환):
   • 프로린 링에 아미노(NH2) 그룹을 추가한 화합물입니다. STAT6에 대한 Ki 값은 10 nM이며, STAT5A/B에 대해서는 각각 2600 nM과 680 nM의 값이 나왔습니다.
   • 이는 STAT6에 대한 결합 친화도가 약간 감소하고, STAT5에 대한 선택성도 일부 낮아졌음을 나타냅니다.
5. 화합물 52 (NHAc 치환):
   • 아세틸화 아미노(NHAc) 그룹을 추가한 화합물로, STAT6에 대한 Ki 값은 6 nM, STAT5A/B에 대해서는 각각 960 nM과 590 nM의 값을 보였습니다.
   • 이는 NHAc 치환이 결합 친화도에 거의 영향을 미치지 않음을 나타냅니다.

결론:

• 이 테이블은 AK-068의 프로린 링에 다양한 치환기를 추가하여 PROTAC 디자인에서 Cereblon 리간드와 연결할 수 있는 테더링 부위를 확보하려는 시도를 설명합니다.
• 결과적으로, 이러한 치환이 STAT6에 대한 결합 친화도에 큰 영향을 미치지 않았으며, 대부분의 경우 STAT6에 대한 높은 선택성을 유지하면서도 테더링 부위를 제공할 수 있었습니다.
• 이를 통해 PROTAC 디자인에 적합한 부위를 선택할 수 있게 되었으며, 특히 OH 또는 OMe 치환은 STAT6 결합 친화도에 거의 영향을 미치지 않으면서 유용한 테더링 부위로 사용할 수 있음을 확인할 수 있었습니다.

 

Table 6: 레날리도마이드 기반의 Cereblon 리간드를 사용한 STAT6 분해제 설계

 

Table 6은 레날리도마이드 기반의 Cereblon 리간드를 사용하여 설계된 STAT6 PROTAC 분해제들의 구조적 modification과 그에 따른 STAT6 단백질 분해 능력을 보여줍니다. 각 화합물은 MV4;11 백혈병 세포주에서 STAT6 단백질의 분해 효율을 평가한 값들로 요약됩니다.

 

주요 데이터:

1. 53–56번 화합물:
   • AK-068을 기반으로 하여 레날리도마이드(Cereblon 리간드)를 연결한 PROTAC 분해제입니다. 각 화합물은 STAT6 분해 효율을 나타내는 DC50 값을 통해 비교됩니다.
   • DC50 값은 260 nM에서 60 nM까지 다양하며, 이는 각 화합물이 STAT6 단백질을 얼마나 효과적으로 분해하는지를 나타냅니다.
   • 예를 들어, 화합물 55는 DC50 = 60 nM으로 STAT6 단백질을 가장 효과적으로 분해했습니다.
2. 화합물 57:
   • 레날리도마이드의 4번 위치가 아닌 5번 위치에 연결한 화합물입니다. 이 화합물의 DC50 값은 200 nM으로, 화합물 55에 비해 4배 덜 효과적입니다. 이 데이터는 레날리도마이드 연결 부위가 STAT6 분해 효율에 중요한 역할을 한다는 것을 보여줍니다.
3. 58, AK-1690, 59, 60:
   • 레날리도마이드와 STAT6 리간드를 연결하는 아마이드 그룹을 에터 그룹으로 변형하여 디자인된 화합물들입니다.
   • 이들 화합물은 매우 높은 STAT6 분해 효율을 보였으며, 특히 AK-1690은 DC50 = 1 nM으로, 가장 강력한 STAT6 분해제로 확인되었습니다.
   • AK-1690은 Dmax > 95%로 STAT6 단백질의 거의 모든 부분을 분해할 수 있음을 보여줍니다.
4. 화합물 61:
   • trans-하이드록시-L-프로린을 사용한 변형체로, DC50 = 130 nM을 기록했습니다. 이 화합물은 AK-1690보다 100배 덜 효과적이었으며, 링커의 방향성이 STAT6 분해 효율에 중요한 영향을 미친다는 것을 시사합니다.

결론:

• 테이블 6은 레날리도마이드 기반 Cereblon 리간드를 연결하여 STAT6 분해 효율을 향상시키는 전략을 보여줍니다.
• AK-1690은 가장 강력한 STAT6 분해제로, 1 nM 수준의 DC50 값을 통해 매우 높은 분해 효율을 기록했습니다.
• 또한, 레날리도마이드의 연결 위치와 링커의 구조적 특성이 PROTAC 디자인에서 중요한 요소임을 확인할 수 있습니다.

 

Figure 2: AK-1690Me 비활성 대조 화합물의 디자인

 

이 그림은 연구팀이 AK-1690의 비활성 대조 화합물로 디자인한 AK-1690Me의 구조와 설계 전략을 설명합니다. AK-1690Me는 STAT6 단백질의 결합 활성에 영향을 미치지 않으면서 STAT6를 목표로 하는 PROTAC 분해 메커니즘에서 유효성을 시험하기 위해 개발되었습니다.

설계 전략:

• 메틸화 변형: AK-1690Me는 AK-1690 구조의 특정 부위에 메틸기를 도입하여 PROTAC 활성의 중요한 상호작용을 억제하는 전략을 사용했습니다. 메틸화는 특히 리간드가 단백질 표적의 활성 부위에서 핵심 상호작용을 하지 못하도록 디자인되었습니다. 이를 통해 AK-1690과 비교해 이 화합물이 단백질 분해에 관여하지 않음을 확인할 수 있습니다.
• STAT6 결합 저해 효과: AK-1690Me는 STAT6 결합 부위에서 AK-1690과 다른 작용을 합니다. 메틸기 도입으로 인한 결합 친화력 감소는 실험을 통해 STAT6에 대한 결합 저해를 검증하는 데 중요한 역할을 합니다.

따라서 이 그림은 메틸화와 같은 화학적 변형이 단백질과 화합물 간의 결합을 어떻게 방해하는지 보여주며, 이는 PROTAC 기술이 정확히 타겟 단백질을 분해할 수 있는지를 평가하는 데 중요한 참고 자료가 됩니다.

 

 

Figure 3: AK-1690과 결합한 STAT6의 공동결정 구조 (PDB ID: 9BIG)

 

그림 3은 STAT6 단백질이 AK-1690과 결합한 공동결정 구조를 보여줍니다. 이 그림은 STAT6 단백질의 구조와 AK-1690이 특정 잔기들과 어떻게 상호작용하는지를 시각적으로 표현하고 있습니다.

 

구조 설명:

1. STAT6의 기본 구조:
   • STAT6 단백질의 백본(Backbone)은 녹색 카툰으로 표현되어 있으며, 단백질의 전반적인 3차원 구조를 나타냅니다.
   • STAT6의 측쇄(Side chains) 중에서 AK-1690과 상호작용하는 특정 잔기들은 스틱(sticks) 형태로 그려져 있습니다.
2. AK-1690의 구조:
   • AK-1690의 탄소 원자는 회색으로, 플루오린 원자는 청록색, 질소 원자는 파란색, 황 원자는 노란색, 인 원자는 주황색, 그리고 산소 원자는 빨간색으로 표시되었습니다.
   • 이러한 색상 코드는 화학 구조의 각 부분을 명확히 구분하여, 분자의 화학적 상호작용을 쉽게 이해할 수 있게 해 줍니다.
3. 수소 결합:
   • 점선은 AK-1690과 STAT6 사이에 형성된 수소 결합을 나타냅니다. 수소 결합은 단백질과 리간드가 안정적으로 결합하는 데 중요한 상호작용을 제공합니다.
   • 이러한 수소 결합은 AK-1690이 STAT6에 강하게 결합하는 기전을 설명하는 중요한 요소입니다.

결과:

 

이 공동결정 구조는 AK-1690이 STAT6의 특정 부위에 어떻게 결합하는지 명확히 보여줍니다. 이를 통해 연구진은 AK-1690이 STAT6을 효율적으로 타겟팅하고 분해할 수 있는 구조적 기초를 제공받을 수 있었습니다. 또한, 이 구조는 STAT6과의 상호작용을 최적화하기 위한 PROTAC 디자인의 근거가 됩니다.

 

 

Figure 4: AK-1690 또는 대조 화합물로 처리한 MV4;11, PBMC, L1236 세포의 STAT 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석

 

그림 4는 STAT6 분해를 평가하기 위해 AK-1690과 대조 화합물인 AK-068 및 AK-1690Me로 처리한 다양한 세포에서의 웨스턴 블롯(Western Blot) 실험 결과를 보여줍니다. 이 그림은 AK-1690이 STAT6 단백질을 효과적으로 분해하는지 확인하는 실험으로, MV4;11 세포주, 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC), 그리고 L1236 호지킨 림프종 세포주에서 이루어졌습니다.

 

(A) MV4;11 세포 처리 결과:

• MV4;11 세포는 12시간 동안 AK-1690과 다른 화합물로 처리되었습니다.
• AK-1690은 DC50 = 1 nM에서 STAT6 단백질을 효과적으로 분해했으며, 95% 이상의 STAT6이 제거되었습니다.
• 대조군인 AK-068(STAT6 리간드)은 STAT6을 분해하지 못했으며, AK-1690Me(비활성 STAT6 분해제) 역시 STAT6 단백질에 영향을 미치지 않았습니다.
• 다른 STAT 단백질인 STAT1, STAT3, STAT5는 10 μM의 AK-1690 농도에서도 영향을 받지 않았습니다.

(B) PBMC 처리 결과:

• PBMC 세포는 18시간 동안 처리되었으며, AK-1690은 DC50 = 80 nM에서 STAT6 단백질을 효과적으로 분해했습니다.
• 다른 STAT 단백질들은 AK-1690에 의해 거의 영향을 받지 않았습니다.
• AK-068과 AK-1690Me는 STAT6을 분해하지 않았습니다.

(C) L1236 세포 처리 결과:

• L1236 호지킨 림프종 세포주는 24시간 동안 처리되었으며, AK-1690은 총 STAT6과 인산화된 STAT6(pSTAT6Y641) 단백질을 농도 의존적으로 감소시켰습니다.
• AK-068과 AK-1690Me는 STAT6이나 pSTAT6에 영향을 미치지 않았습니다.

(D) STAT6 분해 정량화:

• STAT6 분해는 MV4;11 세포주와 PBMC에서 AK-1690에 의해 효과적으로 이루어졌으며, 각각의 실험에서 3번의 독립적인 실험 데이터를 통해 확인되었습니다.

결과:

• 이 실험을 통해 AK-1690은 STAT6을 매우 선택적으로 분해하며, 다른 STAT 단백질에는 영향을 미치지 않는다는 사실이 확인되었습니다.
• AK-068은 STAT6에 대한 높은 결합력을 가지고 있지만, STAT6을 분해하지는 못했습니다. 반면, AK-1690Me는 비활성 PROTAC으로, STAT6을 분해하지 못했습니다.

이 결과는 AK-1690이 STAT6을 타겟으로 하는 매우 강력하고 선택적인 PROTAC이라는 사실을 뒷받침합니다.

 

 

Figure 5: 인간 PBMC에서의 AK-1690 글로벌 단백질 분해 선택성 평가 (프로테오믹스 분석)

 

그림 5는 인간 PBMC(말초 혈액 단핵세포)에서 AK-1690이 STAT6을 선택적으로 분해하는지 확인하기 위해 수행된 프로테오믹스 분석 결과를 보여줍니다. AK-1690을 5 μM 농도로 18시간 처리한 후, 세포 내 단백질 변화가 어떻게 이루어졌는지를 전반적으로 평가하였습니다.

 

주요 내용:

1. 글로벌 단백질 수준 변화:
   • AK-1690 처리 후, 6,000개 이상의 단백질 중 4개의 단백질 수준이 50% 이상 감소했습니다.
   • 이 중 STAT6 단백질 수준은 79% 감소하여, AK-1690이 STAT6에 대해 강력한 분해 능력을 발휘했음을 보여줍니다.
   • 그 외 감소한 단백질들은 EPB41L1(에리트로사이트 막 단백질 4.1), KRT1(케라틴 1), AKR7A3(알도-케토 환원효소 7A3)로 각각 60%, 59%, 51% 감소했습니다.
2. STAT 단백질군의 안정성:
   • STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5 등 다른 STAT 단백질들의 수준은 AK-1690에 의해 유의미하게 변화하지 않았습니다. 이는 AK-1690이 STAT6에 대해 높은 선택성을 가진다는 것을 보여줍니다.
3. 통계적 분석:
   • 실험은 세 번의 독립적인 반복 실험으로 진행되었으며, Student’s t-test를 사용하여 통계적 유의성을 평가했습니다. 이는 결과의 신뢰성을 보장하는 중요한 요소입니다.

결론:

• AK-1690은 글로벌 수준에서 단백질을 선택적으로 분해하며, 특히 STAT6 단백질을 매우 강력하게 타겟팅한다는 것을 확인할 수 있었습니다.
• 다른 STAT 단백질군에는 영향을 거의 미치지 않으면서도, STAT6을 선택적으로 분해하는 능력은 AK-1690의 높은 선택성을 입증하는 중요한 결과입니다.
• 이 데이터를 바탕으로 AK-1690이 STAT6 분해를 목표로 한 약물 디자인에서 중요한 역할을 할 수 있으며, 비특이적 단백질 분해 위험이 적다는 것을 확인할 수 있습니다.

 

Figure 6: Jurkat 세포에서 STAT6 HiBiT 발광 분석을 이용한 AK-1690의 분해 메커니즘 조사

 

그림 6은 STAT6 HiBiT 발광 분석을 사용하여 Jurkat 세포에서 AK-1690의 분해 메커니즘을 조사한 결과를 보여줍니다. 이 실험은 AK-1690이 STAT6 단백질을 어떻게 분해하는지 그 기전을 설명하는 데 중요한 역할을 합니다.

 

실험 구성:

• Jurkat 세포는 HiBiT 태그가 부착된 STAT6 단백질을 발현하도록 처리되었습니다.
• 세포들은 AK-1690 (2 μM), AK-068 (20 μM), 레날리도마이드(20 μM), 또는 MLN4294 (0.5 μM) 처리되었으며, 그 후 5분 간격으로 발광 신호를 측정하여 STAT6 단백질 수준의 변화를 추적했습니다.
• 복합 처리 실험에서는 AK-068, 레날리도마이드, MLN4294를 45분 동안 전처리한 후 AK-1690을 추가하여 STAT6 분해의 조절 여부를 확인했습니다.

주요 결과:

1. AK-1690의 STAT6 분해:
   • AK-1690 (2 μM)는 시간에 따라 발광 신호가 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 STAT6 단백질의 감소를 반영합니다. 이 결과는 AK-1690이 STAT6을 효과적으로 분해함을 보여줍니다.
2. AK-068과의 복합 처리:
   • AK-068은 STAT6에 높은 결합력을 갖지만, 단독으로는 발광 신호를 유의미하게 변화시키지 않았습니다.
   • AK-068과 AK-1690을 복합 처리한 경우, AK-068이 AK-1690에 의한 STAT6 분해를 억제하는 효과가 나타났습니다. 이는 AK-068이 STAT6 분해에 필요한 자리를 차지해 AK-1690의 작용을 방해했음을 시사합니다.
3. 레날리도마이드와의 상호작용:
   • 레날리도마이드는 자체적으로 STAT6 발광 신호에 영향을 미치지 않았지만, AK-1690과 레날리도마이드를 함께 처리했을 때, STAT6 분해가 완전히 차단되었습니다. 이는 AK-1690이 Cereblon을 통해 STAT6을 분해하는 데 레날리도마이드와 경쟁한다는 것을 보여줍니다.
4. MLN4294와의 상호작용:
   • MLN4294는 E1 neddylation 억제제로, 자체적으로는 STAT6 발광 신호에 영향을 주지 않았습니다.
   • 그러나 MLN4294와 AK-1690을 함께 처리한 경우, STAT6 분해가 완전히 차단되었습니다. 이는 AK-1690에 의한 STAT6 분해가 neddylation 과정에 의존한다는 사실을 시사합니다.

결론:

• AK-1690은 STAT6 분해를 유도하는 강력한 PROTAC이며, 그 메커니즘은 Cereblon과의 결합 및 neddylation 과정을 통해 작동합니다.
• AK-068은 STAT6과의 결합을 방해함으로써 AK-1690의 작용을 저해할 수 있습니다.
• 이 실험을 통해 AK-1690이 PROTAC 메커니즘을 통해 STAT6을 효과적으로 분해한다는 것을 명확히 알 수 있으며, 그 작용이 Cereblon 및 neddylation에 의존함을 확인할 수 있었습니다.

 

Figure 7: Jurkat 세포에서 Cereblon Neo-Substrates에 대한 AK-1690의 웨스턴 블롯 분석

 

그림 7은 Jurkat 세포에서 AK-1690이 Cereblon neo-substrates인 IKZF1, IKZF2, IKZF3, GSPT1 단백질에 미치는 영향을 조사한 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석 결과를 보여줍니다. 이 실험은 AK-1690이 STAT6 이외에 Cereblon에 의해 표적화되는 다른 단백질들에도 영향을 미치는지 확인하기 위한 실험입니다.

 

실험 구성:

• Jurkat 세포는 AK-1690으로 20시간 동안 다양한 농도에서 처리되었습니다.
• 처리 후 IKZF1, IKZF2, IKZF3, 그리고 GSPT1 단백질의 수준을 특정 항체를 사용한 면역 블롯(immunoblotting)을 통해 확인했습니다.
• GAPDH 또는 β-actin을 로딩 컨트롤로 사용하여, 각 실험에서 동일한 단백질 양이 사용되었음을 보장했습니다.

주요 결과:

• AK-1690은 20시간 처리 후, IKZF1, IKZF2, IKZF3, GSPT1 단백질 수준에 유의미한 영향을 미치지 않았습니다.
  • 이는 AK-1690이 Cereblon을 통한 STAT6 분해에는 영향을 미치지만, IKZF1-3 및 GSPT1과 같은 다른 neo-substrates에는 영향을 주지 않음을 나타냅니다.
  • 특히 IKZF1-3은 종종 Cereblon과 관련된 표적 단백질이므로, AK-1690이 이 단백질들에 영향을 주지 않는다는 점은 선택성 면에서 중요한 결과입니다.

결론:

• AK-1690은 STAT6을 선택적으로 분해하며, Cereblon에 의해 표적화되는 다른 단백질들(예: IKZF1, IKZF2, IKZF3, GSPT1)에는 영향을 미치지 않습니다.
• 이 결과는 AK-1690이 STAT6에 대한 높은 선택성을 갖고 있으며, 비표적 단백질에 대한 비특이적 영향을 최소화함을 확인할 수 있었습니다.
• 이러한 선택성은 STAT6 분해제로서의 AK-1690의 효능을 더욱 강조합니다.

 

 

Table 7: Microsomal and Plasma Stability of AK-1690 in Five Different Species

 

Table 7에서는 AK-1690의 미세소체와 혈장 안정성을 다섯 가지 다른 종(마우스, 랫, 개, 원숭이, 인간)에서 평가한 결과가 제공됩니다. 이 분석은 화합물의 대사와 혈장 내 분해 정도를 파악하기 위해 중요한 데이터를 제공합니다. 이는 약물이 각각의 종에서 얼마나 안정적으로 대사되지 않는지를 확인하고, 인체에서의 잠재적 약물 대사와 배설 경로를 예측하는 데 매우 유용합니다.

 

내용 설명:

1. 미세소체 안정성(Microsomal Stability):
   각 종의 간 미세소체에서 AK-1690의 반감기(t1/2)가 측정됩니다. 간 미세소체는 간 내의 대사 효소(CYP450 등)를 포함하고 있어, 미세소체 안정성 테스트는 약물이 대사 효소에 의해 얼마나 빨리 분해되는지 평가합니다. 반감기가 길수록 대사 저항성이 높다는 것을 의미하며, 짧을수록 대사 효소에 의해 빠르게 분해됩니다.
2. 혈장 안정성(Plasma Stability):
   AK-1690이 혈장 내에서 얼마나 안정적으로 유지되는지를 확인하는 실험입니다. 혈장에는 다양한 가수분해 효소가 존재하므로, 이 실험은 약물이 체내에서 가수분해될 가능성을 평가하는 데 중요한 정보를 제공합니다.

결과 해석:

• 각 종에서 AK-1690의 반감기가 다르게 나타납니다. 예를 들어, 인간의 미세소체에서 반감기가 길다면, 이는 인간에서 약물이 대사에 더 저항성이 있어 장기간 혈중에 남을 수 있음을 시사합니다. 반대로, 특정 동물에서 반감기가 짧다면 그 동물에서 약물이 빠르게 대사될 수 있음을 의미합니다.
• 미세소체 및 혈장 안정성 데이터는 신약 개발 초기 단계에서 매우 중요하며, 특히 약물의 안전성과 효능을 예측하고 인간 임상시험으로 넘어가기 전에 종간 차이를 분석하는 데 유용합니다.

이 데이터를 바탕으로 AK-1690이 인간과 비슷한 대사 프로파일을 보이는 동물을 선택해 전임상 시험에서 사용할 수 있습니다.

 

 

Figure 8: AK-1690의 폐 및 간에서의 약력학(PD) 연구

 

Figure 8은 AK-1690의 in vivo 약력학적 효과를 평가한 결과입니다. 실험에서는 Balb/c 암컷 마우스에게 200 mg/kg의 AK-1690을 복강 주사로 투여한 후, 폐와 간 조직에서 STAT6 단백질의 변화를 면역 블롯(immunoblotting)을 통해 분석하였습니다.

 

실험 세부사항:

• 마우스는 AK-1690을 단회 투여 받았으며, 2시간, 6시간, 24시간 후에 조직 샘플을 채취하였습니다.
• 각 시간대에서 조직 내 STAT6 단백질의 수준을 면역 블롯으로 분석하여 AK-1690의 STAT6 분해 효과를 평가했습니다.

주요 결과:

1. 간 조직에서의 효과:
   • 2시간, 6시간, 24시간 동안 모두 간에서 STAT6 단백질의 90% 이상이 분해되었습니다.
2. 폐 조직에서의 효과:
   • 폐 조직에서도 AK-1690은 2시간 동안 70%, 6시간 동안 90%, 그리고 24시간 동안 70%의 STAT6 단백질을 분해했습니다.

결론:

• AK-1690은 in vivo 실험에서 폐와 간 조직에서 STAT6 단백질을 효과적으로 분해하는 능력을 입증했습니다.
• 약물 투여 후 24시간 동안 STAT6이 지속적으로 분해되었으며, 이는 AK-1690의 장기적인 분해 효과와 생체 내 약물 효능을 나타냅니다.

Summary:

STAT6은 다양한 질병 치료를 위한 잠재적 타겟으로 연구되었으나, 강력하고 선택적인 STAT6 억제제의 개발은 지난 20년간 지체되었습니다. 본 연구에서는 PROTAC 기술을 사용하여 첫 번째 강력하고 선택적인 STAT6 분해제인 AK-1690을 개발하였습니다.

 

처음에 Ki = 3.5 μM의 결합력을 가진 STAT6 리간드(화합물 1)에서 시작해 구조 기반 설계를 통해 AK-068을 발견하였으며, 이 리간드는 Ki = 6 nM의 결합력을 가지며, STAT5A 및 STAT5B에 비해 각각 150배, 85배 이상 선택적인 특성을 보였습니다.

 

AK-068과 Cereblon 리간드를 결합하고, 연결부 및 연결 위치를 최적화하여 AK-1690을 디자인하였습니다. AK-1690은 MV4;11 백혈병 세포주에서 DC50 = 1 nM으로 STAT6 단백질을 효과적으로 분해하였으며, 다른 STAT 단백질에는 거의 영향을 미치지 않았습니다. PBMC 세포에서는 DC50 = 80 nM과 Dmax > 90%의 STAT6 분해 효과를 보였으며, 다른 STAT 단백질에는 영향을 주지 않았습니다. 또한, L1236 림프종 세포주에서는 AK-1690이 STAT6 및 인산화 STAT6을 분해하는 데 성공했으나, AK-068은 인산화 STAT6을 억제하지 못했습니다.

 

프로테오믹스 분석에서는 AK-1690이 18시간 동안 79%의 STAT6을 분해했으며, 6,000개의 다른 단백질에는 유의미한 영향을 주지 않았습니다. 미세소체 및 혈장 안정성 실험에서는 AK-1690이 우수한 안정성을 보여 in vivo 연구에 적합한 도구 화합물로 평가되었습니다. 마우스에서 AK-1690은 폐 및 간에서 STAT6을 효과적으로 분해하였으며, 히스타민 유도 저혈량증을 완화하는 데 기여했습니다.

 

따라서, AK-1690은 STAT6을 타겟으로 한 신약 개발의 유망한 후보물질로 평가됩니다.

 

더 자세한 세부 내용은 Journal of Medicinal Chemistry, September 23, 2024. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.4c01009 에서 찾아 보시기 바랍니다.