🌿 간신증후군 치료를 위한 고효율 천연 항산화제 스크리닝과 형광 탐지 기술 🌿

이 논문의 연구는 새로운 형광 탐침(H–PRh)을 개발하여 간신증후군에서 발생하는 과도한 과산화질소(ONOO–)를 감지하고, 이를 활용하여 천연 항산화제 중에서 효과적인 약물 후보를 찾아내는 것을 목표로 합니다.

 

핵심 내용:

형광 탐침 H–PRh 개발:

• 기존의 형광 탐침은 자체 형광이 있어서 민감도가 떨어지는 문제가 있었습니다.
• 이를 해결하기 위해 "제로" 자체 형광 특성을 가진 H–PRh를 설계했습니다.
• H–PRh는 ONOO–와 반응하면 형광을 발현하여 ONOO–의 존재를 민감하게 감지할 수 있습니다.

 

항산화제 후보물질 스크리닝:

• H–PRh를 이용하여 다양한 천연 항산화제를 테스트했습니다.
• 그 결과, 루테올린이 ONOO– 수준을 효과적으로 감소시키는 것을 발견했습니다.

 

간신증후군 모델에서의 적용:

• 생쥐 모델을 사용하여 H–PRh의 실용성을 검증했습니다.(in vivo)
• 간신증후군을 유도한 생쥐에서 H–PRh를 활용해 ONOO–의 증가를 확인했습니다.
• 루테올린 처리 그룹에서는 ONOO– 수준이 감소하는 것을 확인했습니다.

 

루테올린의 작용 메커니즘:

• 루테올린이 Sirt1-Nrf2-HO-1 신호 경로를 활성화하여 항산화 효과를 나타낸다는 것을 발견했습니다.
• 이는 루테올린이 단순히 화학적으로 ONOO–를 제거하는 것뿐만 아니라, 세포 수준에서 항산화 방어 시스템을 강화한다는 것을 의미합니다.

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새로운 형광 탐침(H–PRh)  발견의 의미:

• 높은 민감도와 선택성: H–PRh 탐침은 자체 형광이 없어 매우 민감하고 정확하게 ONOO–를 감지할 수 있습니다.
• 신약 개발의 도구: 이 탐침을 이용한 고속 스크리닝 방법은 새로운 항산화 약물 후보를 찾는 데 유용합니다.
• 질병 이해와 치료: 간신증후군에서의 ONOO– 역할과 루테올린의 치료 효과를 밝힘으로써, 향후 치료 전략 개발에 기여할 수 있을 것으로 기대합니다.

 

실험 결과에 대한 그림 설명은 아래를 참고 하세요. 

 

 

 

 

Figure 1은 세 가지 주요 부분으로 구성되어 있습니다.

 

과거 ONOO⁻ 탐지 프로브 디자인 전략의 도식도 (Figure 1a): 기존의 ONOO⁻ 탐지 프로브는 형광이 활성화되기 전에 높은 본연의 형광 신호를 보이며, ONOO⁻과 반응한 후에는 형광 신호가 억제되거나 변화하는 방식이 많았습니다. 이와 같은 기존 전략은 생체 내에서 높은 선택성을 보이기에는 한계가 있었습니다​.

 

본 연구에서 개발된 비접합(nonconjugated) 전략 (Figure 1b): 이 연구에서는 비접합 전략을 사용하여, 형광 신호를 최소화한 상태에서 ONOO⁻에 반응할 때만 형광 신호가 증폭되는 시스템을 개발했습니다. 이를 통해, 형광 신호의 간섭을 최소화하고 ONOO⁻에 대한 높은 선택성과 반응성을 확보할 수 있었습니다​.

 

세 가지 형광 물질의 화학 구조와 선택성 실험 (Figure 1c): 이 그림은 각각의 형광 프로브인 H-Rh, H-SiRh, H-PRh의 화학 구조를 보여주며, 이들이 다양한 ROS(활성산소종)에 대해 어떻게 반응하는지를 설명합니다.

 

실험 결과, H-PRh가 다른 활성산소종에 비해 ONOO⁻에 대해 가장 높은 선택성을 보였습니다. 선택성 실험에서는 100 μM의 H₂O₂, ClO⁻, OH⁻, O₂⁻, 그리고 기타 활성산소종들이 테스트되었고, ONOO⁻에만 현저한 형광 증폭이 나타났습니다​.

본 논문의 연구에서 새롭게 개발된 ONOO⁻ 감응 형광 프로브의 설계 전략과 성능을 설명하며, 기존 탐지 시스템과의 차별화를 명확하게 보여줍니다.

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Figure 2는 H-PRh 형광 프로브의 과산화질소(ONOO⁻) 감지 특성을 다양한 실험을 통해 설명합니다. 각각의 부분을 단계별로 설명하도록 하겠습니다.

 

H-PRh의 UV-Vis-NIR 흡수 스펙트럼 (Figure 2a): H-PRh(10 μM)의 흡수 스펙트럼은 다양한 ONOO⁻ 농도에서 측정되었습니다. 712nm에서 새로운 흡수 피크가 나타났는데, 이는 ONOO⁻가 H-PRh와 반응해 형광 물질인 PRh를 형성했기 때문입니다 .

 

형광 스펙트럼 (Figure 2b): ONOO⁻가 존재할 때, H-PRh의 형광 강도가 733nm에서 급격히 증가했습니다. 이 형광 증가는 PRh의 π-공액 구조가 형성된 결과로, ONOO⁻가 H-PRh와 반응해 강력한 형광 신호를 나타냅니다 .

 

농도-의존적 형광 변화 곡선 (Figure 2c, d): ONOO⁻ 농도(0-40 μM)와 형광 강도 사이에 명확한 선형 관계가 나타났으며, 검출 한계는 18.9 nM으로 계산되었습니다. 이는 H-PRh가 ONOO⁻에 대해 매우 민감한 형광 센서임을 보여줍니다 .

 

선택성 평가 (Figure 2e): 다른 활성산소종(ROS) 및 생체 분자들과의 비교 실험에서, **ONOO⁻**에 의해서만 강한 형광 증폭이 발생하였고, 다른 물질들에 의한 간섭은 거의 없었습니다. 예를 들어, H₂O₂, ClO⁻, OH⁻, O₂•⁻ 등은 형광 강도에 거의 영향을 미치지 않았습니다 .

 

반응 속도 평가 (Figure 2f): H-PRh는 ONOO⁻가 추가되었을 때 빠르게 형광 강도가 증가하였으며, 이는 매우 빠른 반응성을 나타냅니다. 이로 인해 실시간 모니터링에 적합한 프로브임을 확인할 수 있었습니다.

 

색상 변화 (Figure 2g, h): ONOO⁻ 농도에 따른 색상 변화가 시각적으로 관찰되었습니다. H-PRh 용액은 ONOO⁻와 반응하여 무색에서 푸른색으로 변하여 육안으로도 ONOO⁻를 탐지할 수 있음을 보여줍니다.

 

이 결과를 통해 H-PRh가 높은 감도와 선택성, 빠른 반응성을 지닌 형광 프로브로서 ONOO⁻를 효과적으로 탐지할 수 있음을 이해할 수 있습니다.

 

 

 

Figure 3는 세포 내에서 ONOO⁻(과산화질소)의 형광 이미징과 검출 능력을 평가한 실험 결과를 보여줍니다.

 

다양한 세포주에서의 형광 이미지 (Figure 3a): H-PRh 프로브(10 μM)를 HL-7702, PC-12, HeLa, HepG2, 4T-1 세포에 처리한 후, 형광 이미지를 촬영했습니다. 결과적으로, 각각의 세포주에서 다양한 형광 강도가 나타났으며, 이는 각 세포 내 ONOO⁻의 내재 수준이 다름을 보여줍니다​.

 

미토콘드리아와의 공동 위치 형광 이미지 (Figure 3b): HepG2 세포에서 H-PRh와 MitoTracker Green을 사용해 이중 염색한 결과, H-PRh가 미토콘드리아에 주로 위치함이 확인되었습니다. 이는 과산화질소가 주로 미토콘드리아에서 생성된다는 사실을 시사하며, Pearson의 상관계수 0.90으로 높은 일치도를 보여주었습니다​.

 

세포 간독성 모델에서 ONOO⁻ 검출 및 치료 후 형광 변화 (Figure 3c): 아세트아미노펜(APAP)으로 간독성을 유도한 후, H-PRh를 처리하여 형광 강도를 측정했습니다. APAP 그룹에서는 강한 형광 신호가 나타났으나, N-아세틸시스테인(NAC)을 추가 처리한 그룹에서는 형광 강도가 현저히 감소했습니다. 이는 NAC가 활성산소종을 제거하는 효과를 보여줍니다​.

 

형광 강도 비교 (Figure 3d): APAP 처리 그룹과 NAC 처리 그룹의 형광 강도를 비교한 결과, NAC를 처리한 그룹에서 형광 강도가 유의미하게 감소한 것을 확인할 수 있었습니다. 데이터는 평균 ± 표준편차(n = 3)로 제시되었으며, 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다(*P < 0.001)​.

 

이 결과를 통해 H-PRh가 세포 내에서 ONOO⁻를 감지할 수 있는 뛰어난 형광 프로브임을 확인할 수 있으며, ONOO⁻의 생성 및 감소를 실시간으로 모니터링할 수 있는 유용한 도구로 활용될 수 있음을 시사합니다.

 

 

 

Figure 4는 HepG2 세포에서 H-PRh 형광 프로브를 사용하여 천연 항산화제를 고효율 스크리닝한 결과를 보여줍니다.

 

고효율 스크리닝 실험 과정의 도식 (Figure 4a): 이 도식은 HepG2 세포에서 H-PRh를 사용해 다양한 천연 항산화제를 스크리닝하는 실험 과정을 시각적으로 나타냅니다. HepG2 세포를 100 μM의 천연 항산화제와 12시간 동안 전처리한 후, 10 μM의 H-PRh로 염색하여 형광 이미지를 획득했습니다​.

 

HepG2 세포의 형광 이미지 (Figure 4b): 실험 결과, 다양한 천연 항산화제 처리 후의 HepG2 세포에서 형광 강도가 달라졌습니다. 이는 항산화제가 세포 내 ONOO⁻ 생성에 미치는 영향을 보여주며, 특정 항산화제는 형광 신호를 효과적으로 감소시켰습니다​.

 

핫 이미지로 표시된 형광 강도 분포 (Figure 4c): 각 천연 제품으로 처리한 세포의 형광 강도는 열 지도(hot-image) 형태로 표현되었으며, 이를 통해 형광 강도의 상대적인 차이를 직관적으로 볼 수 있습니다​.

 

형광 강도의 정량적 분석 (Figure 4d): Luteolin과 Quercetin을 포함한 몇 가지 천연 제품이 ONOO⁻ 생성 감소에 탁월한 효과를 나타냈습니다. 특히, Luteolin은 형광 강도를 절반 이상 감소시켜 강력한 항산화제로 확인되었습니다​.

 

이 결과는 H-PRh를 사용한 고효율 스크리닝 방법이 새로운 항산화제 탐색에 있어 매우 효과적임을 보여주며, Luteolin이 ONOO⁻ 축적을 줄이는 데 유효한 천연 항산화제임을 입증합니다.

 

 

Figure 5는 간신증후군(hepatorenal syndrome) 마우스 모델에서 H-PRh 형광 프로브를 사용해 간과 신장에서 과산화질소(ONOO⁻) 생성의 변화를 모니터링한 결과를 보여줍니다.

 

간신증후군 모델 구축과 형광 이미징 실험 과정의 도식 (Figure 5a): 이 도식은 마우스 모델에서 간신증후군을 유도하고, H-PRh 형광 프로브를 주입한 후 NIR 형광 이미징 실험이 수행된 과정을 설명합니다. 마우스는 세 그룹으로 나누어졌습니다.

 

• 대조군: 생리식염수 100 μL 주입.
• 간신증후군 모델군: D-갈락토사민(100 μL, 100 mg/kg)을 사용해 간신증후군을 유도.
• 치료군: 루테올린(100 μL, 10 mg/kg)을 투여한 후 H-PRh를 주입​.

 

In vivo 형광 이미지 (Figure 5b): H-PRh 형광 프로브를 주입한 후, 30분 뒤 마우스의 복부를 NIR 형광 카메라로 촬영한 결과, 대조군에 비해 간신증후군 모델군에서 형광 강도가 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었습니다. 반면, 루테올린을 투여한 치료군에서는 형광 강도가 유의미하게 감소했습니다. 이는 ONOO⁻ 생성이 억제되었음을 나타냅니다​.

 

Ex vivo 신장 및 간 형광 이미지 (Figure 5c, 5d): 마우스를 희생시키고 신장과 간을 채취해 ex vivo 형광 이미지를 촬영한 결과, 간신증후군 모델군에서 신장과 간에서의 형광 강도가 모두 증가한 반면, 루테올린 처리군에서는 형광 강도가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었습니다​.

 

신장 및 간의 형광 강도 비교 (Figure 5e, 5f): 신장과 간의 형광 강도를 정량적으로 비교한 결과, 간신증후군 모델군에서 형광 강도가 가장 높았으며, 루테올린 처리군에서 그 수치가 유의미하게 낮았습니다. 이는 루테올린이 간신증후군 동안 발생하는 ONOO⁻ 축적을 억제하는 데 효과적임을 보여줍니다​.

 

이 결과를 통해 H-PRh 형광 프로브를 이용한 실시간 ONOO⁻ 모니터링이 간신증후군 연구에 효과적인 방법임을 확인할 수 있습니다.

 

 

 

Figure 6는 간신증후군 모델 마우스에서 간과 신장의 조직 절편을 형광 이미징과 H&E 염색을 통해 분석한 결과를 보여줍니다.

 

신장 및 간 조직의 형광 이미지 (Figure 6a-c): (a): 대조군, (b): 간신증후군 그룹, (c): 루테올린 치료군.

각 그룹의 신장 및 간 조직 절편에서 H-PRh 형광 프로브(빨간 채널)와 DAPI 염색(파란 채널)이 사용되었습니다. 간신증후군 그룹은 대조군에 비해 신장과 간 모두에서 형광 강도가 높게 나타났으며, 이는 과산화질소(ONOO⁻) 축적을 시사합니다. 반면, 루테올린 치료군은 형광 강도가 현저히 감소하여, 항산화제인 루테올린이 ONOO⁻ 축적을 억제하는 효과를 나타냈습니다 .

 

H&E 염색 이미지 (Figure 6d-f): (d): 대조군, (e): 간신증후군 그룹, (f): 루테올린 치료군.

H&E 염색을 통해 간신증후군 그룹에서 신장과 간의 손상이 뚜렷하게 나타났습니다. 예를 들어, 간세포 부종, 지방 대사 장애, 그리고 간세포 괴사가 관찰되었습니다. 반면 루테올린을 투여한 치료군에서는 이러한 손상 증상이 현저히 줄어들었습니다 .

 

이 결과들은 H-PRh 형광 프로브가 간신증후군 동안 신장 및 간에서의 ONOO⁻ 축적을 실시간으로 모니터링할 수 있는 유용한 도구임을 보여주며, 루테올린이 강력한 항산화제로서 이러한 과산화질소 축적을 억제하는 데 효과적임을 입증합니다

 

 

Figure 7는 루테올린이 간신증후군에 미치는 산화저항 메커니즘을 분석한 결과를 설명합니다. 두 가지 주요 부분으로 구성됩니다.

 

간에서의 Sirt1, Nrf2, HO-1 단백질 발현 분석 (Figure 7a): Western blot 분석을 통해 간신증후군 모델 마우스와 루테올린 처리군의 간에서 Sirt1, Nrf2, HO-1 단백질의 발현을 비교했습니다. 간신증후군 모델에서 이 단백질들의 발현이 감소된 반면, 루테올린 처리 후에는 발현이 유의미하게 증가했습니다. 이는 루테올린이 항산화 방어 경로를 활성화하여 간 손상을 완화하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다​.

 

루테올린이 활성화하는 생물학적 신호 경로 (Figure 7b): 제시된 도식은 루테올린이 Sirt1 및 Nrf2 경로를 통해 항산화 효과를 발휘하는 메커니즘을 설명합니다. Sirt1은 항산화 방어 경로를 조절하는 핵심 인자로, Nrf2와 HO-1의 발현을 촉진시킵니다. Nrf2는 세포 내 산화 스트레스를 줄이는 주요 전사인자로 알려져 있으며, HO-1은 항산화 효소로 작용합니다​.

 

이 결과는 루테올린이 간신증후군에서 과산화질소(ONOO⁻) 축적을 억제하고, 항산화 방어 경로를 활성화하여 간 손상을 줄이는 데 효과적임을 보여줍니다.

 

결론:

이 논문에서의 연구는 새로운 형광 탐침 H–PRh를 통해 간신증후군에서 중요한 역할을 하는 ONOO–를 효과적으로 감지하고, 이를 활용하여 루테올린과 같은 천연 항산화제를 찾아내는데 성공했습니다. 이는 향후 간신증후군과 관련된 질병의 진단과 치료에 중요한 기반을 제공할 것으로 기대됩니다. 

 

 

PS. 자세한 내용은 다음 저널을 확인하세요.  J. Med. Chem. 2024 https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.4c01858