Structural and Physicochemical Features of Oral PROTACs

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Journal of Medicinal ChemistryVol 67/Issue 15 Article July 30, 2024

제목 : Structural and Physicochemical Features of Oral PROTACs

Approach 방법:

PROTACs의 개념과 필요성 설명
- PROTACs는 Proteolysis Targeting Chimeras로, 세포 내 표적 단백질을 분해하기 위해 설계된 화합물입니다. PROTAC는 E3 리가제와 표적 단백질에 결합하여 이들을 근접하게 만들어 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 표적 단백질을 분해합니다. PROTACs는 약 550~1600 Da의 큰 분자 크기를 가지며, 경구 흡수를 달성하는 것이 도전 과제입니다.
경구 투여 가능성을 높이는 PROTAC 설계의 어려움
- PROTACs는 Lipinski의 Rule of 5(분자량 500Da 이하, H-bond donors ≤ 5, H-bond acceptors ≤ 10 등)을 위반하는 경우가 많기 때문에, 경구 투여가 어려운 화합물로 분류됩니다.
- 이 논문에서는 solvent-exposed H-bond donor (eHBD)와 acceptor (eHBA)라는 새로운 실험적 지표를 도입하여 경구 흡수율을 예측합니다.
PROTAC의 경구 흡수율 및 구조 분석
- 실험을 통해 쥐, 개, 마우스 모델에서 4가지 임상 PROTAC의 약동학적 성질(PK)을 분석했습니다.
- 또한 NMR 분석을 통해 분자가 용액 상태에서 어떻게 구조적으로 배열되는지 조사하여 경구 투여 가능성을 평가했습니다.
경구 흡수율을 위한 새로운 설계 규칙 제안
- 실험 결과에 따라 eHBD가 2 이하일 경우 경구 흡수율이 높다는 사실을 발견했습니다.
- 경구 투여가 가능한 PROTAC 설계를 위한 새로운 규칙인 "Rule-of-oral-PROTACs"를 제안했습니다. 이는 기존의 Rule of 5보다 더 유연한 기준을 가지면서도 eHBD가 2 이하일 때 경구 흡수율을 예측할 수 있다는 내용을 포함하고 있습니다.

결과 요약:

논문에서는 4가지 임상 PROTAC에 대한 구조적 및 물리화학적 분석이 이루어졌으며, 주요 결과는 다음과 같습니다.

분자 크기, 극성, 회전 결합 수, eHBD, eHBA 등의 물리화학적 지표를 측정하여 PROTAC의 경구 흡수 가능성을 예측.
경구 흡수율이 높은 PROTAC은 eHBD 값이 2 이하로, 수소 결합이 적을수록 경구 흡수율이 향상된다는 결론을 도출.
쥐, 개, 마우스 모델에서 경구 흡수율(F%)이 실험적으로 측정되었으며, 각 동물 모델에서 20% 이상의 경구 흡수율을 가진 PROTAC을 확인.

Figure 1. HBD shielding in clinical-stage oral PROTACs. 1H NMR spectra of the left-hand side H-bond donor (HBD) in CDCl3 and DMSO-d6 reveal shielding from solvation in CDCl3 only (green arrow/background) and in both solvents (yellow arrow/background) or exposure to solvation (gray arrow/background) with temperature-dependent 1H chemical shift changes (values displayed in ppb/K) of ≥ −3.0 in CDCl3 and ≥ −3.5 in DMSO-d6 for NH donors or > −4.5 in either solvent for OH donors indicating shielding. The right-hand side glutarimide HBD was solvent exposed in all cases.

Figure 1에서는 임상 단계에서 사용된 PROTAC의 H-bond donor (HBD) shielding 여부를 NMR로 분석한 결과가 나옵니다.

NMR 분석은 PROTAC이 apolar(비극성) 환경과 극성 환경에서 HBD가 용매로부터 얼마나 shielding 되는지를 보여줍니다.
예를 들어, ARV-766이라는 PROTAC은 글루타리미드 HBD가 모든 경우에서 용매에 노출되어 있어 eHBD 값이 1로 나타났습니다.
이 값이 2 이하이면 경구 흡수율이 높아지는 경향이 있습니다.

배경지식: NMR (핵자기 공명법)은 분자의 구조적 정보를 제공하는 강력한 도구입니다. PROTAC의 경우, HBD가 용매와 얼마나 상호작용하는지가 중요한데, 이는 PROTAC이 세포막을 통과할 때 중요한 역할을 합니다. 세포막은 apolar 환경이므로 HBD가 shielding 된 경우가 경구 흡수율이 높습니다.

Figure 2. Near neighbor PROTACs with 1, 2, and 3 eHBDs. Solvent-exposed H-bond donors (eHBD, orange), HBDs shielded in CDCl3 only (light green) or shielded in CDCl3 and DMSO-d6 (yellow) are highlighted along with in vivo clearance (CL) and oral bioavailability (F%). a AR degraders, b ERα degraders with eHBD changes that preserve or lose F% highlighted by green and red arrows, respectively.

Figure 2에서는 PROTAC의 eHBD (solvent-exposed H-bond donor) 수에 따라 경구 흡수율(F%)이 어떻게 달라지는지에 대해 설명하고 있습니다. 이 Figure에서는 AR degrader (안드로겐 수용체 분해제)와 ERα degrader (에스트로겐 수용체 분해제)를 비교합니다.

eHBD = 1인 PROTACs는 경구 흡수율이 58%에 이르며 매우 우수한 흡수율을 보였습니다.
반면, eHBD = 3인 경우, 경구 흡수율은 2%로 크게 떨어졌습니다.

배경지식: eHBD는 PROTAC의 수소 결합 공여자(HBD) 중 용매에 노출된 부분을 의미합니다. 수소 결합이 많을수록, 특히 용매와의 상호작용이 많은 경우, 약물이 세포막을 통과하기 어려워져 흡수율이 낮아집니다. 따라서 eHBD 수가 낮을수록 경구 투여 시 흡수율이 높아질 가능성이 큽니다.

이 Figure는 eHBD ≤ 2일 때 경구 흡수율이 높다는 연구의 핵심 결론을 보여줍니다.

Table 1은 4가지 임상 단계의 PROTAC에 대한 물리화학적 특성 및 약동학적 데이터를 요약한 것입니다. 이 표는 각 PROTAC의 분자량 (MW), lipophilicity (LogD 및 chromLogD), polar surface area (tPSA 및 ePSA), HBD 및 HBA 값, 그리고 in vivo clearance (CL)와 oral bioavailability (F%)를 제공합니다.

MW (Molecular Weight): PROTAC의 분자량은 모두 700~866 Da 범위에 있으며, 이는 일반적인 작은 분자 약물보다 큰 값을 나타냅니다.
LogD 및 chromLogD: 물질의 지질 친화성을 나타내며, ARV-471의 경우 chromLogD가 5.3으로 가장 높습니다. 이는 약물이 세포막을 더 쉽게 통과할 수 있음을 시사합니다.
tPSA 및 ePSA: 분자의 극성 표면적을 나타냅니다. ARV-471의 경우 tPSA 값이 96 Å²로 다른 PROTAC에 비해 매우 낮아 경구 흡수에 유리한 구조로 보입니다.
HBD/eHBD 값: eHBD는 모든 PROTAC에서 2 이하로, 경구 흡수에 유리한 구조를 가지고 있음을 확인할 수 있습니다.
F% (경구 흡수율): 각 PROTAC의 경구 흡수율은 실험 동물 모델(마우스, 랫드, 개)에 따라 다르지만, ARV-766은 마우스 모델에서 58%로 가장 높은 경구 흡수율을 보였습니다.

이 표를 통해 PROTAC의 물리화학적 특성과 경구 흡수율 사이의 상관관계를 명확히 알 수 있습니다. 특히 eHBD가 2 이하일 때 경구 흡수율이 높아지는 경향이 있다는 사실을 재확인할 수 있습니다.

Figure 3. 3D conformers of clinical oral PROTACs free in solution by NMR. Shielded HBD – HBA interactions (yellow arrows) and not-freely rotatable torsion angles (lock symbols) are highlighted. Equatorial 1,4-substitution vectors (light blue boxes) on saturated 6-rings enforce extended rather than backfolded 3D conformations.

Figure 3에서는 임상 단계 경구 PROTACs의 3D 구조를 NMR을 사용하여 용액 상태에서 분석한 결과를 보여줍니다. 이 그림은 PROTAC이 용액 내에서 어떻게 구조적으로 배열되는지, 그리고 그 구조적 특징들이 경구 흡수율에 어떻게 기여하는지를 설명합니다.

핵심 요소:

shielded HBD와 HBA 상호작용 (shielded HBD – HBA interactions):
- 노란색 화살표는 shielding 된 HBD와 HBA (H-bond acceptor) 간의 상호작용을 나타냅니다. 이는 분자 내에서 수소 결합 공여자(HBD)가 수소 결합 수용자(HBA)와 어떻게 결합하고 있는지를 시각적으로 보여줍니다.
- 이런 차폐는 PROTAC이 극성 환경에서 극성을 숨기는 방식을 설명하며, 이는 경구 투과성을 높일 수 있습니다.(이전에 이야기했던 분자내 수소결합을 유도하여 PSA를 줄여서 경구화를 높이는 방법과 동일 approach)
회전할 수 없는 이중 결합 (not-freely rotatable torsion angles):
- 자물쇠 모양의 기호는 PROTAC의 일부 결합이 회전할 수 없는 이중 결합임을 나타냅니다. 이 구조적 특성은 PROTAC의 3D 형태를 고정시켜, 단백질 표적에 더 효과적으로 결합할 수 있도록 합니다.
- 이러한 고정된 구조는 PROTAC이 목표 단백질과의 결합에 유리하게 작용하며, 특히 E3 리가제와의 효율적인 상호작용을 지원합니다.
포화된 6각 고리의 1,4-치환 벡터 (equatorial 1,4-substitution vectors):
- 밝은 파란색 상자는 포화된 6각 고리에서 1,4-치환이 이루어진 벡터를 나타냅니다. 이 치환 패턴은 backfolded 구조 대신 extended 3D conformer를 강제하는 역할을 합니다.
- extended conformer는 PROTAC이 더 안정적으로 세포막을 통과하고, 목표 단백질과 결합하는 데 도움이 됩니다. backfolded conformer는 접힌 구조로 인해 표적 접근이 어렵거나 비효율적일 수 있습니다.

배경지식:

NMR 분석은 분자가 용액 상태에서 어떻게 배열되는지를 밝혀내는 중요한 방법으로, 특히 PROTAC의 3D 구조를 이해하는 데 필수적입니다.
shielded HBD는 PROTAC이 극성 환경에서 극성을 숨기고, 비극성 환경에서는 투과성을 높이는 역할을 합니다.
extended conformation은 PROTAC이 세포막을 통과할 때 더욱 효율적이며, 목표 단백질에 결합하는 데 유리한 구조로, PROTAC의 설계에 중요한 요소입니다.

이 Figure는 PROTAC이 backfolded가 아닌 extended conformer를 유지하는 구조적 특성을 설명하며, 이는 경구 흡수율을 최적화하는 데 중요한 역할을 합니다.

Figure 4. S-ARV-766 is preorganized in solution to recognize cereblon. a Trans and b cis conformers of the cereblon-binding moiety of S-ARV-766 refined by QM calculation with their carbonyl to carbonyl oxygen distances and DFT-calculated chemical shifts of the H atom highlighted in yellow. The experimental 1H chemical shift value is 4.73 ppm. c Trans conformer with S-stereochemistry overlaid with the crystal structure of lenalidomide (light green) bound to cereblon (dark green, PDB-ID = 4ci2), showing the 4 intermolecular H-bond interactions (cyan cylinders) and the van-der-Waals interaction with W386. d Overlay of the trans R-conformer as in c showing 2 fewer H-bond interactions (highlighted yellow).

Figure 4에서는 S-ARV-766의 3D 구조와 cereblon 단백질과의 결합 구조를 분석합니다.

Figure 4a, 4b: S-ARV-766의 두 가지 가능한 3D 구조(Trans와 Cis)가 제시됩니다. 두 구조는 글루타리미드 부분의 carbonyl group(카보닐 그룹)과 2-fluorobenzamide(2-플루오로벤즈아마이드) 부분이 서로 다른 방향으로 배열됩니다.
- Trans conformer는 에너지적으로 더 안정적이며, 실험적으로도 더 우세한 구조입니다.
- Cis conformer는 이보다 에너지적으로 불안정하고 실험에서 덜 관찰됩니다.
Figure 4c, 4d: Trans conformer와 S-lenalidomide(세레블론에 결합하는 기존 약물)의 구조가 겹쳐지며, S-ARV-766이 cereblon과 결합할 때 4개의 수소 결합을 형성하는 것이 확인됩니다. 반면, R-ARV-766은 두 개의 수소 결합을 잃게 됩니다.
- 이로 인해 S-ARV-766이 R-ARV-766보다 더 효율적으로 cereblon과 결합하여 단백질 분해를 촉진하는 능력이 뛰어납니다.

Trans와 Cis 구조는 분자의 공간적 배열을 말하는데, Trans 구조는 더 안정적이고 결합력도 좋습니다. S-ARV-766의 Trans conformer가 안정적으로 cereblon과 강력하게 결합하는 이유가 이 Figure에서 설명됩니다.

Figure 5. Preorganization of ARV-471 free in solution. Overlay of the solution conformer of S-ARV-471 (dark gray) with the crystal structure of S-lenalidomide (orange, PDB-ID = 4ci2) bound to cereblon, and the crystal structure of lasofoxifene (green, PDB-ID = 2ouz) bound to ERα (rmsd = 0.2 Å).

Figure 5에서는 S-ARV-471의 3D 구조와 cereblon 및 ERα (에스트로겐 수용체)와의 결합을 보여줍니다.

S-ARV-471의 3D 구조는 cereblon에 결합할 때 S-lenalidomide와 매우 유사한 방식으로 결합합니다. 이 구조가 cereblon과 결합하는 동안, ERα에도 효과적으로 결합할 수 있도록 사전 구조적 준비(preorganization)가 되어 있음을 보여줍니다.
또한, ERα에 결합할 때 lasofoxifene이라는 기존 약물의 구조와 완벽하게 일치하는 부분이 있음을 강조합니다.

배경지식:

Preorganization은 약물이 목표 단백질에 결합하기 전, 구조적으로 적합한 형태를 미리 갖추고 있다는 개념입니다. 이는 약물의 효능을 높이는 데 중요한 역할을 합니다.
ERα (에스트로겐 수용체)는 특정 유방암 치료에서 중요한 타겟 단백질이며, S-ARV-471이 이 수용체에 강하게 결합하는 것이 이 논문에서 중요한 성과로 제시됩니다.

논문에 포함된 4가지 임상 PROTAC에 대한 in vivo 약동학적 데이터를 요약입니다. 이 Table에는 각 PROTAC의 경구 흡수율(F%), Clearance (CL), 반감기 (T1/2) 등이 포함됩니다.

Table 2. PROTAC의 In Vivo 약동학적 데이터

PROTAC - Mouse F% - Rat F% - Dog F% - CL (mL/min/kg) - T1/2 (hours) - Vss (L/kg)

ARV-766	58%	38%	33%	4.2 (Mouse)	6.8 (Mouse)	2.3 (Mouse)
ARV-110	65%	51%	14%	3.9 (Mouse)	13 (Mouse)	3.8 (Mouse)
KT-474	24%	7%	51%	17 (Mouse)	4.0 (Mouse)	2.7 (Mouse)
ARV-471	59%	24%	5%	35 (Mouse)	6.2 (Mouse)	9.4 (Mouse)

이 표는 경구 흡수율(F%)이 각 동물 모델에서 어떻게 다른지 보여줍니다. 특히 ARV-766은 모든 동물 모델에서 안정적으로 높은 흡수율을 보였으며, KT-474는 Mouse에서 낮은 흡수율을 보이지만 Dog 모델에서 흡수율이 높았습니다.

배경지식:

Clearance (CL)는 약물이 체내에서 제거되는 속도를 의미하며, T1/2 (반감기)는 약물 농도가 반으로 줄어드는 시간을 나타냅니다. 이 값들이 낮을수록 약물이 더 오래 체내에 남아있고, 경구 투여 시에도 효과를 발휘할 가능성이 높아집니다.
Vss (Volume of Distribution)는 약물이 체내에 얼마나 넓게 분포하는지를 나타냅니다. ARV-471의 경우 Vss 값이 매우 높아 전신 분포가 큰 약물임을 의미합니다.

Figure 6. Oral PROTACs physicochemical properties. a Clinical PROTACs ARV-766, ARV-110, ARV-471 and KT-474 and b 30 AstraZeneca (AZ) PROTACs (multicolored dots) with F ≥ 20% in 2 out of 3 preclinical species, exceed the Ro5/Veber limits except for eHBD. Numbers on axis show the computed Ro5/Veber limits. Data points show the experimental property values on the uncorrected Ro5/Veber axis (ePSA in Å2, MW in Da). The experimental “Rule-of-oral-PROTACs” area (green dashed line) is eHDB ≤ 2, ePSA ≤ 170, eRotB ≤ 13, MW ≤ 1000, chromLogD ≤ 7 and eHBA ≤ 16.

Figure 6에서는 PROTACs의 물리화학적 특성을 시각적으로 비교하여, 경구 흡수율(F%)이 20% 이상인 PROTAC과 그렇지 않은 PROTAC의 특성을 비교합니다. 또한, Rule-of-5와 Veber 규칙을 기준으로 경구 흡수율이 높은 PROTAC들이 이 기준을 얼마나 넘어서는지를 보여줍니다.

x축: 분자량(Molecular Weight, MW)으로, PROTAC의 크기를 나타냅니다. PROTAC들은 일반적인 Rule of 5에서 제한하는 500Da를 넘어서 1000Da까지 허용됩니다.
y축: polar surface area (PSA)로, 분자의 극성 표면적을 나타냅니다. 일반적으로 PSA 값이 140 Å²를 넘으면 경구 흡수에 불리하지만, 경구 흡수율이 20% 이상인 PROTAC들은 170 Å²까지 허용됩니다.
색상과 점의 크기는 각 PROTAC의 다른 물리화학적 특성, 즉 lipophilicity (chromLogD), rotatable bonds, 그리고 eHBD의 개수를 나타냅니다.

결론:

경구 흡수율이 20% 이상인 PROTAC들은 MW, PSA, lipophilicity 값이 기존의 Rule of 5를 크게 초과합니다. 그러나 흡수율을 결정하는 데 가장 중요한 요인은 eHBD ≤ 2라는 것을 이 Figure에서 확인할 수 있습니다.

Rule of 5는 경구 흡수율을 예측하기 위한 기준으로, 분자량 500Da 이하, HBD ≤ 5, HBA ≤ 10, LogP ≤ 5 등을 제한합니다. 하지만 bRo5(beyond Rule of 5) 약물은 이 규칙을 초과하는 경우가 많습니다. PROTAC처럼 큰 분자들은 새로운 설계 기준이 필요하며, 이 논문에서는 eHBD ≤ 2라는 기준을 제시하고 있습니다.

PROTAC의 물리화학적 특성과 경구 흡수율(F%)을 비교하여 정리한 데이터입니다. 이 표는 각 PROTAC의 MW, chromLogD, PSA, eHBD와 그에 따른 경구 흡수율을 보여줍니다.

Table 3. PROTAC의 물리화학적 특성과 경구 흡수율 비교

PROTAC - MW (Da) - LogD - PSA (Å²) - eHBD - F% (Mouse) - F% (Rat) - F% (Dog)

ARV-766	808	5.0	114	1	58%	38%	33%
ARV-110	812	5.1	116	1	65%	51%	14%
KT-474	866	2.3	124	1	24%	7%	51%
ARV-471	724	5.3	146	2	59%	24%	5%
PROTAC 5	810	5.1	130	3	2%	NA	NA
PROTAC 6	765	4.8	120	2	45%	NA	NA

이 표를 통해 확인할 수 있는 중요한 결과는 다음과 같습니다.

MW와 chromLogD는 경구 흡수율과 반드시 직접적인 상관관계를 가지지 않습니다. ARV-110과 ARV-766은 높은 분자량과 높은 lipophilicity에도 불구하고 경구 흡수율이 높습니다.
eHBD는 PROTAC의 경구 흡수율에 강한 영향을 미치며, eHBD ≤ 2일 때 흡수율이 20% 이상이지만, eHBD = 3인 PROTAC 5는 흡수율이 매우 낮습니다.
chromLogD는 분자의 지질 친화성을 나타내며, 값이 높을수록 지질 이중층을 더 잘 통과할 수 있습니다. 하지만 너무 높은 값은 독성을 유발할 수 있습니다.
PSA는 분자가 극성 표면을 얼마나 가지고 있는지를 나타내며, intestinal membrane permeability(장내막 투과성)에 영향을 줍니다. 보통 PSA가 140 Å² 이하인 약물이 경구 흡수율이 높지만, PROTAC의 경우 더 높은 값도 허용됩니다.

(추가)

1. 임상 단계의 PROTAC들이 solvent-exposed H-bond donor (eHBD)와 acceptor (eHBA) 수에 따라 어떻게 경구 흡수율에 영향을 받는지를 분석합니다. 또한, PROTAC의 intramolecular hydrogen bonding (IMHB)을 포함하여 구조적 변화를 시각적으로 보여줍니다.

eHBD가 2 이하인 PROTAC들은 경구 흡수율이 높고, IMHB가 형성된 경우 PROTAC의 극성 표면적이 줄어들어 경구 투과율이 더욱 향상됩니다.
이 Figure는 각각의 PROTAC들이 apolar 환경(비극성 환경)과 polar 환경(극성 환경)에서 어떻게 다른 구조적 변화를 겪는지 보여줍니다.
IMHB (Intramolecular Hydrogen Bonding)는 분자 내에서 형성된 수소 결합으로, 분자의 구조를 안정화하고 극성을 감소시켜 경구 흡수를 돕는 중요한 요소입니다. IMHB는 특히 세포막을 통과하는 큰 분자 약물에서 중요한 역할을 합니다.
eHBA는 용매에 노출된 수소 결합 수용자 수를 의미하며, 역시 분자의 극성에 큰 영향을 미칩니다.

PROTAC이 비극성 환경에서 chameleonicity(카멜레온 구조)로 불리는 구조적 변화를 겪어 극성 표면적을 줄이고, 경구 투과성을 향상시킬 수 있다는 점을 시각적으로 설명하고 있습니다.

2. PROTAC들이 intramolecular hydrogen bond (IMHB)를 형성했을 때와 그렇지 않았을 때의 polar surface area (PSA) 및 경구 흡수율(F%)을 비교한 데이터를 포함하고 있습니다.

Table 4. IMHB 형성 여부에 따른 PROTAC의 PSA 및 경구 흡수율

PROTACIMHB 여부PSA (Å²)eHBDF% (Mouse)F% (Rat)F% (Dog)

ARV-766	있음	114	1	58%	38%	33%
ARV-110	있음	116	1	65%	51%	14%
KT-474	있음	124	1	24%	7%	51%
ARV-471	없음	146	2	59%	24%	5%
PROTAC 5	없음	130	3	2%	NA	NA

결론:

IMHB를 형성한 PROTAC들은 PSA가 낮아지고, 이로 인해 경구 흡수율이 크게 증가합니다.
ARV-471은 IMHB를 형성하지 않았음에도 불구하고 흡수율이 상대적으로 높았지만, 그 이유는 eHBD가 2 이하이기 때문입니다.
PROTAC 5는 IMHB를 형성하지 않고 eHBD가 3이기 때문에 흡수율이 매우 낮습니다.
IMHB는 약물이 세포막과 같은 비극성 환경을 통과할 때, 수소 결합 공여자 및 수용자 부분이 내향적으로 접히면서 극성을 숨기는 현상입니다. 이로 인해 약물의 PSA가 줄어들고 세포막을 통과하는 능력이 증가합니다.

3. PROTAC 5의 3D 구조가 분석되며, VHL 리간드를 통해 E3 리가제와 결합하는 방식이 나타납니다. 또한 IMHB가 형성되지 않은 경우와 형성된 경우의 차이점을 비교합니다.

IMHB가 형성되지 않은 경우: PROTAC 5는 용매에 노출된 수소 결합 공여자가 많아 극성이 높아지고, 그 결과 경구 투과성이 낮아집니다.
IMHB가 형성된 경우: 극성이 감소하여 PSA가 줄어들고, 경구 투과성이 높아질 가능성이 있지만, PROTAC 5는 이 특성을 활용하지 못해 경구 흡수율이 낮습니다.
VHL 리간드는 PROTAC이 VHL (Von Hippel-Lindau) E3 리가제에 결합하여 표적 단백질을 분해하는 데 사용되는 부분입니다. 이 리간드는 PROTAC의 핵심 역할을 하며, 효율적인 결합이 PROTAC의 단백질 분해 효과를 좌우합니다.

4. 임상 단계 PROTAC의 3D 분자 동역학(MD) 시뮬레이션 결과를 제시하여, PROTAC이 solvent environment (용매 환경)에서 어떻게 움직이는지를 보여줍니다.

MD simulation은 PROTAC이 polar (극성) 및 apolar (비극성) 환경에서 어떤 구조적 변화를 겪는지 시각적으로 분석합니다.
이 시뮬레이션을 통해 PROTAC이 apolar 환경에서 어떻게 극성을 줄여 세포막 투과성을 증가시키는지 알 수 있습니다.
ARV-471과 같은 PROTAC들은 용액 상태에서 trans conformer로 존재하며, 이는 목표 단백질과 결합할 준비(preorganization)가 되어 있는 상태를 의미합니다.
MD simulation은 분자의 움직임을 시간에 따라 추적하여, 용매나 세포막 같은 환경에서 어떻게 구조가 변화하는지를 분석하는 기법입니다. 이를 통해 PROTAC의 chameleonicity(카멜레온 특성)을 확인할 수 있으며, 이는 분자가 환경에 따라 극성 표면적을 줄이는 능력을 의미합니다.

PROTAC이 apolar 환경에서 어떻게 극성 표면적을 줄이는지, 그리고 목표 단백질에 결합하기 위해 적합한 구조로 미리 준비될 수 있는지를 시각적으로 보여줍니다.

5. PROTAC의 3D 구조와 MD simulation에서 얻은 데이터를 바탕으로 한 solvent 환경에서의 conformer stability를 보여줍니다. 이 표는 각 PROTAC이 polar 및 apolar 환경에서 어떤 conformer 형태로 더 안정적인지를 비교합니다.

Table 5. PROTAC의 Solvent 환경에 따른 Conformer 안정성 비교

PROTAC - Conformer - Polar Environment Stability - Apolar Environment Stability

ARV-766	Trans	낮음	높음
ARV-110	Trans	중간	높음
KT-474	Cis/Trans	낮음	높음
ARV-471	Trans	중간	높음

결론:

Apolar 환경에서는 모든 PROTAC들이 trans conformer로 안정적인 구조를 유지하여, 세포막 투과성이 높아지는 것으로 나타났습니다.
Polar 환경에서는 일부 PROTAC들이 상대적으로 불안정하지만, Apolar 환경에서 세포막을 통과하는 데 필요한 구조를 유지하고 있다는 점이 중요합니다.
Conformer는 분자가 취할 수 있는 다양한 3D 형태 중 하나를 의미하며, trans conformer는 일반적으로 더 안정적입니다. Apolar 환경은 세포막과 유사한 환경으로, 이 환경에서의 안정성은 경구 흡수율과 직접적으로 연결됩니다.

6. 임상 단계 PROTAC이 Cereblon과 결합한 후, ubiquitinylation을 통해 표적 단백질을 분해하는 전체 과정입니다.

PROTAC이 E3 리가제(Cereblon)와 표적 단백질에 결합하여 ternary complex를 형성한 후, ubiquitin이 표적 단백질에 부착됩니다.
ubiquitinylation이 완료되면, Proteasome이 이를 인식하여 표적 단백질을 분해합니다.
PROTAC은 단순한 결합제가 아니라, 단백질을 분해하기 위해 설계된 화합물입니다. 이 과정은 ubiquitin-proteasome system (UPS)을 통해 이루어지며, 이 시스템은 세포 내 불필요하거나 손상된 단백질을 제거하는 데 필수적입니다.
Ternary complex는 PROTAC이 표적 단백질과 E3 리가제에 동시에 결합하여 형성된 복합체를 말하며, 이 복합체가 형성되어야 ubiquitinylation이 가능해집니다.

PROTAC이 어떻게 표적 단백질을 분해하는지를 전체적으로 보여줍니다. 이는 PROTAC의 작용 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다.

이 논문은 Rule of 5 (Ro5) 규칙에 대해 도전하며, 500 Da 이상의 분자량을 가진 약물에서 Ro5의 유효성을 재검토합니다. 특히 Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs)와 같은 큰 분자들은 전통적인 Ro5를 벗어나며, 더 적절한 특성 지표가 필요합니다. 연구는 경구 흡수율이 높은 PROTAC에서 solvent-exposed H-bond donors (eHBD)가 2 이하일 때 흡수율이 증가한다는 것을 발견했습니다. 이는 Ro5에서 규정하는 HBD ≤ 5보다 훨씬 낮은 수치입니다.

주요 발견

eHBD ≤ 2라는 새로운 컷오프를 제안하여, 실험적으로 측정된 HBD 차폐가 PROTAC 설계에 더 적합하다는 것을 보여주었습니다.
- 이는 특히 Ro5에서 단순히 HBD 수를 계산하는 방식이 PROTAC 설계에 적합하지 않을 수 있음을 나타냅니다.
- 예를 들어, PROTAC ARV-766과 PROTAC 5는 HBD sheilding이 잘 일어나 실험에서 더 높은 경구 흡수율을 보였습니다.
ePSA (experimental polar surface area)와 eHBD를 포함한 실험적 물리화학적 지표들이 PROTAC 설계에 필수적임을 강조했습니다. 이는 전통적인 계산된 물리화학적 지표(예: tPSA)가 실험치와 최대 50% 차이가 나는 등 오차가 발생할 수 있음을 지적합니다.

새로운 설계 규칙

기존 Ro5와 달리 PROTAC의 물리화학적 특성을 재정의한 Rule-of-oral-PROTACs 규칙을 제안했습니다.
- 분자량 ≤ 1000 Da,
- chromLogD ≤ 7,
- ePSA ≤ 170 Å²,
- eRotB ≤ 13,
- eHBA ≤ 16이라는 새로운 컷오프가 필요하며,
- 특히 eHBD ≤ 2가 가장 중요합니다.
In vitro 장 투과성 분석(예: Caco-2 assay)은 PROTAC에서 낮은 회수율로 인해 신뢰성이 떨어질 수 있으며, 이러한 실험 대신 실험적 분자 극성과 수소 결합 sheilding를 직접 측정하는 것을 권장했습니다.

결론

PROTAC 설계에서 중요한 물리화학적 특성들을 실험적으로 측정하는 것이 중요하며, Ro5의 제한을 넘어서는 beyond Rule of 5 (bRo5) 공간에서 PROTAC과 같은 대분자 약물의 설계에 기여할 수 있습니다.
특히 eHBD ≤ 2라는 새로운 컷오프는 PROTAC의 경구 흡수율을 높이는 중요한 기준이며, 이는 기존의 HBD ≤ 5 규칙을 초과하는 분자에서도 유효함을 보였습니다.

연구 결과는 1 mg/kg의 경구 투여 용량에 기반한 결과이며, 더 높은 용량의 경우에 대해서는 일반화하기 어렵다고 경고합니다.