CW-3308의 개발: 선택적이고 경구투여 가능한 BRD9 PROTAC 분해제

논문 "CW-3308의 개발: 선택적이고 경구투여 가능한 BRD9 PROTAC 분해제"는 CW-3308이라는 화합물을 개발하여 BRD9 단백질을 표적으로 하는 치료제 개발에 관한 연구입니다. 이 연구는 BRD9이 다양한 암에서 중요한 역할을 하며, 이를 효과적으로 표적화할 수 있는 PROTAC 기술을 활용한 분해제를 개발하는 것을 목표로 하고 있습니다. 아래는 연구 내용을 자세히 정리한 것입니다.

 

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1. 실험 목적

이 연구의 주요 목적은 BRD9 단백질을 표적으로 하여 강력하고 선택적이며 경구 투여가 가능한 PROTAC 분해제를 개발하는 것입니다. BRD9은 활막육종, 악성라브도이드 종양과 같은 희귀 암에서 중요한 역할을 하며, 이를 억제하거나 분해할 수 있는 화합물은 잠재적으로 효과적인 치료제가 될 수 있습니다. 기존 BRD9 억제제는 BRD9의 활성을 완전히 억제하지 못해, 완전한 단백질 분해를 유도할 수 있는 PROTAC 기술이 필요합니다.

2. 약물 개발 접근법

• PROTAC 기술: PROTAC (Proteolysis Targeting Chimera) 기술은 목표 단백질을 특이적으로 분해하기 위해 설계된 합성 화합물을 사용합니다. 이 연구에서는 새로운 tricyclic cerebron 리간드인 TX-11-Me와 TX-16-Me를 이용하여 BRD9 분해제를 설계했습니다.
• BRD9 억제제의 선택: BRD9의 브로모도메인을 타겟으로 하는 BI-7273이라는 기존 억제제를 기반으로 하여 새로운 분해제를 설계했습니다. BI-7273의 구조를 수정하여 cerebron 리간드와 결합할 수 있는 PROTAC 분해제를 개발했습니다.
• 링커의 최적화: 링커는 PROTAC 분해제에서 목표 단백질과 E3 리가아제 사이의 적절한 결합을 위해 매우 중요한 요소입니다. 이 연구에서는 다양한 길이와 구조의 링커를 평가하여 최적의 PROTAC 분해제를 도출했습니다.

3. 실험 결과 해석

• CW-3308의 설계와 개발:
  • 초기 설계: BI-7273의 구조를 기반으로 TX-11-Me와 결합시켜 초기 BRD9 분해제를 설계했습니다. 이 과정에서 다양한 링커 구조를 실험하여 최적의 분해제 효능을 찾았습니다.
  • 링커 조정: 첫 번째 시도에서 얻은 화합물(예: CW-3185)은 높은 BRD9 분해 효능을 보였지만 경구 생체이용률이 낮았습니다. 이후 링커 구조와 cerebron 리간드를 조정하여 CW-3308을 개발하게 되었습니다.
• 활성 평가:
  • CW-3308의 분해 능력: CW-3308은 BRD9 단백질을 매우 효과적으로 분해했으며, 특히 G401 라브도이드 종양 세포주와 HS-SY-II 활막육종 세포주에서 강력한 효능을 보였습니다. HiBit 분석 결과, 1nM 농도에서 BRD9 단백질 수준을 68%까지 감소시켰으며, 이는 기존 dBRD9 분해제보다 우수한 결과입니다.
  • 선택성: CW-3308은 BRD9에 대해 매우 높은 선택성을 보였으며, BRD7 및 BRD4와 같은 관련 단백질에는 거의 영향을 미치지 않았습니다. 이는 CW-3308이 타겟 단백질에 대해 매우 특이적으로 작용함을 의미합니다.
• 약동학적 특성:
  • 경구 생체이용률: 마우스 모델에서 CW-3308은 91%의 경구 생체이용률을 기록했습니다. 또한, 양호한 약동학적 특성을 보였으며, 체내에서 안정적인 반감기와 적절한 조직 분포를 나타냈습니다.
  • 약물 분포 및 지속성: CW-3308은 경구 투여 후 3시간 내에 높은 혈장 및 종양 조직 농도를 달성했으며, 24시간 후에도 종양 내에서 상당한 농도가 유지되었습니다.
• BRD9 단백질 분해 기전:
  • CW-3308이 BRD9을 효과적으로 분해하는 메커니즘을 확인하기 위해, BRD9 억제제(BI-7273)와 cerebron 리간드(레날리도마이드)를 사용한 실험을 진행했습니다. 그 결과, CW-3308은 BRD9과 cerebron 에 결합하여 분해를 유도하며, 이는 PROTAC 기술의 원리를 잘 따르고 있음을 확인했습니다.

4. 토론 및 결론

연구 결과, CW-3308은 강력한 BRD9 분해 능력과 우수한 경구 생체이용률을 갖춘 유망한 화합물로 평가되었습니다. 특히 BRD9 단백질에 대한 높은 선택성은 CW-3308이 활막육종 및 악성라브도이드 종양과 같은 BRD9 의존성 암 치료에 적합한 후보 물질임을 나타냅니다. 추가적인 연구와 최적화 과정을 통해 CW-3308은 잠재적으로 새로운 암 치료제로 개발될 가능성이 큽니다.

5. 최종 결과 요약

 

CW-3308은 현재까지의 연구에서 매우 긍정적인 결과를 보였으며, 앞으로도 더욱 폭넓은 연구와 최적화를 통해 암 치료제 개발에 중요한 기여를 할 것으로 기대됩니다.

 

아래는 각각의 그림과 테이블에 대한 세부 내용 정리입니다. 

 

 

Figure 1은 이전에 보고된 대표적인 BRD9 억제제와 분해제의 화학적 구조를 보여줍니다. 이 그림은 BRD9에 대한 다양한 접근 방식을 시각적으로 요약하며, 약물 개발의 역사적 맥락과 함께 최근 개발된 분해제들의 특성을 살펴보겠습니다.

주요 내용:

1. BI-7273:
   • BRD9의 브로모도메인을 표적으로 하는 강력한 억제제입니다. BI-7273은 높은 결합 친화도를 가지지만, 단순 억제제로서 BRD9의 전체적인 유전자 전사 활성화를 완전히 억제하지는 못합니다.
   • 이 억제제는 구조적으로 단순하지만, BRD7과 BRD4에도 결합하는 등 선택성에서 제한이 있습니다.
2. dBRD9:
   • BI-7273을 기반으로 한 최초의 PROTAC(프로탁) 분해제로, BRD9을 선택적으로 분해할 수 있는 능력을 가지고 있습니다.
   • 이 화합물은 BI-7273과는 달리 단순 억제가 아닌, CRBN을 통해 BRD9을 분해함으로써 세포 성장 억제 효과를 크게 높였습니다.
3. VZ185:
   • BI-7273의 디메틸아민 부분을 피페라진으로 대체하고, 이를 VHL 리간드에 연결하여 합성된 이중 BRD7/BRD9 분해제입니다.
   • 이 화합물은 BRD9뿐만 아니라 BRD7도 표적으로 삼아, 더욱 넓은 범위의 세포 성장 억제 효과를 나타냅니다.
4. EA-89와 QA-68:
   • EA-89는 새로운 BRD9 브로모도메인 억제제이며, QA-68은 EA-89를 기반으로 설계된 CRBN 기반 PROTAC입니다.
   • QA-68은 급성 백혈병 및 다발성 골수종 세포주에서 강력한 효능과 선택성을 보였습니다.
5. C6:
   • 최근에 개발된 경구 투여 가능 BRD9 분해제로, 급성 골수성 백혈병 치료를 목적으로 개발되었습니다.
   • 이 화합물은 높은 경구 생체이용률과 강력한 BRD9 분해 능력을 특징으로 합니다.
6. CFT8634와 FHD-609:
   • CFT8634는 경구 투여 가능하며, FHD-609는 정맥 주사 형태로 개발된 BRD9 분해제입니다. 두 화합물 모두 활막육종 및 SMARCB1 결손 고형 종양 환자 치료를 위해 임상 개발에 들어갔습니다.
   • 그러나 FHD-609는 임상 시험 중 심각한 부작용으로 인해 임상이 중단되었으며, CFT8634 역시 효과 부족으로 임상 시험이 중단되었습니다 .

이러한 구조적 차이와 개발 역사는 BRD9 타겟 약물의 진화와 각 화합물의 장단점을 이해하는 데 중요한 정보입니다. 특히, 초기 억제제에서 PROTAC 분해제로의 전환은 BRD9 관련 질병 치료에 있어 사실상 큰 변화를 가져왔습니다.

 

 

 

Figure 2는 논문에서 레날리도마이드와 탈리도마이드를 기반으로 한 두 가지 유형의 세레블론(CRBN) 리간드를 설계한 내용입니다. 이 리간드는 BRD9 단백질을 분해하는 PROTAC을 개발하는 데 사용되었습니다.

1. 배경 및 목적:
   • 연구진은 PROTAC 기술을 활용하여 BRD9 단백질을 효과적으로 분해할 수 있는 화합물을 개발하고자 했습니다. 이를 위해 cerebron (CRBN)이라는 E3 유비퀴틴 리가아제에 결합할 수 있는 리간드가 필요했습니다. 이 리간드는 목표 단백질인 BRD9을 유비퀴틴화하여 분해를 유도하는 데 중요한 역할을 합니다.
   • 탈리도마이드와 그 유도체인 레날리도마이드는 잘 알려진 CRBN 리간드로, PROTAC 설계에 자주 사용됩니다. 그러나 이 연구에서는 이 리간드의 특성을 개선하기 위해 TX-11-Me와 TX-16-Me라는 새로운 트리사이클릭 CRBN 리간드를 설계했습니다.
2. TX-11-Me와 TX-16-Me의 설계:
   • TX-11-Me와 TX-16-Me는 탈리도마이드와 레날리도마이드의 구조를 수정하여 설계된 화합물입니다. 이 구조 수정은 약물의 결합 친화성, 세포 투과성, 대사 안정성, 경구 생체이용률을 최적화하기 위한 것입니다.
   • 결합 친화성: 새로 설계된 리간드인 TX-11-Me와 TX-16-Me는 탈리도마이드와 레날리도마이드와 비슷한 수준의 세레블론에 대한 결합 친화성을 보여, 구조 수정이 CRBN과의 상호작용에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다.
   • 세포 투과성: 이 새로운 리간드들은 세포막을 통한 중등도에서 좋은 수준의 투과성을 보여, 약물이 세포 내 목표 지점에 효과적으로 전달될 수 있음을 시사합니다.
   • EFFUX 비율: TX-11-Me는 중간 정도의 배출 비율을 나타내어 일부 화합물이 세포 밖으로 배출될 가능성이 있지만, TX-16-Me는 거의 배출되지 않아 세포 내에 더 오래 남아 있을 가능성이 높습니다. 이는 효과적인 약물 작용을 기대할 수 있는 중요한 특성입니다.
   • 대사 안정성: 두 리간드 모두 여러 종(마우스, 쥐, 개, 원숭이, 인간)의 간 미세소체에서 뛰어난 안정성을 보여, 체내에서 빠르게 분해되지 않고 안정적으로 유지될 가능성이 높습니다.
3. 결론:
   • 연구 결과, TX-11-Me와 TX-16-Me는 BRD9 분해제를 설계하기에 적합한 리간드임이 확인되었습니다. 이 리간드들은 결합 친화성, 세포 투과성, 대사 안정성 등의 면에서 우수한 특성을 나타냈으며, 이후 CW-3308과 같은 BRD9 분해제를 합성하는 데 사용되었습니다.

이 그림은 PROTAC 분자를 최적화하는 과정에서 리간드의 효능, 안정성, 생체이용률 등을 고려한 설계의 중요성을 강조하고 있습니다​.

 

Table 1은 두 가지 세레블론(CRBN) 리간드인 TX-11-Me와 TX-16-Me의 특성을 분석한 결과입니다. 이 표는 레날리도마이드와 탈리도마이드를 비교 기준으로 하여, 새로운 리간드들이 세레블론에 대한 결합 친화성, 세포 투과성, 대사 안정성, 그리고 약동학적 프로필에서 어떤 특성을 보이는지를 설명합니다.

주요 항목 요약:

1. 세레블론 결합 친화성 (CRBN Binding Affinity):
   • TX-11-Me의 결합 친화성 Ki 값은 2.7 μM로, 기존 탈리도마이드와 유사합니다.
   • TX-16-Me의 결합 친화성은 1.4 μM로, 레날리도마이드와 유사하며 더 나은 결합력을 보여줍니다.
   • 결론적으로, 두 새로운 리간드는 탈리도마이드와 레날리도마이드에 비해 충분히 높은 결합 친화성을 유지합니다.
2. 세포 투과성 (Caco-2 Permeability):
   • TX-11-Me는 Papp (10^-6 cm/s) 값이 2.55로 중등도의 세포 투과성을 보이며, efflux ratio는 2.67로 P-gp 기질로 작용하여 세포 밖으로 배출될 가능성이 있습니다.
   • TX-16-Me는 Papp 값이 7.44로, 훨씬 더 높은 세포 투과성을 나타내며, efflux ratio는 1.07로 거의 배출되지 않아 세포 내에 더 오래 유지될 가능성이 큽니다.
3. 간 미세소체 대사 안정성 (Liver Microsomal Stability):
   • 두 리간드 모두 >60분의 반감기를 기록하며, 마우스, 쥐, 개, 원숭이, 인간을 포함한 다양한 종에서 높은 대사 안정성을 보여줍니다. 특히 TX-16-Me는 원숭이에서 54분의 반감기를 보입니다.
4. 쥐에서의 약동학적 프로필 (Pharmacokinetic Profile in Rats):
   • TX-11-Me는 경구 투여 시 60%의 생체이용률을 보였고, TX-16-Me는 70%의 더 높은 생체이용률을 나타냈습니다.
   • 두 리간드 모두 경구 투여 시 좋은 약동학적 프로필을 보여주며, 경구 투여 가능한 BRD9 분해제를 설계하기에 적합합니다​.

이 표의 결과는 TX-11-Me와 TX-16-Me가 강력하고 경구 투여 가능한 BRD9 분해제를 개발하는 데 적합한 리간드임을 나타냅니다. TX-16-Me는 특히 높은 세포 투과성과 적은 배출로 인해 더 유망한 후보로 평가됩니다.

Figure 3는 BRD9 PROTAC 분해제를 설계하는 데 중요한 구조적 정보를 제공하는 그림입니다. 이 그림은 두 부분으로 구성되어 있습니다:

(A) BRD9와 BI-7273 억제제의 공동결정 구조 (PDB 5EU1):

• BRD9 억제제 결합: 이 구조는 BRD9 단백질이 선택적인 브로모도메인 억제제인 BI-7273과 어떻게 결합하는지를 보여줍니다. BI-7273은 BRD9을 표적으로 하는 PROTAC 분해제를 설계하기 위한 기반으로 사용됩니다.
• 주요 상호작용: 이 구조에서는 BI-7273의 디메틸아민 그룹이 용매에 노출되어 있음을 확인할 수 있습니다. 이 그룹이 노출되어 있기 때문에, 이 위치에 세레블론 리간드를 연결하여 PROTAC을 설계할 수 있습니다. BI-7273의 이 부분은 설계된 PROTAC 분해제가 BRD9에 효과적으로 결합하도록 하는 중요한 연결 지점입니다.
• 결합 메커니즘: BI-7273의 다른 중요한 부분은 N-메틸 그룹이 BRD9의 친수성 포켓 깊숙이 결합한다는 것입니다. 이와 함께 나프티리딘-1(2H)-온 구조는 BRD9의 타이로신 106번 (TYR106)과 pi-pi 상호작용을 통해 안정적으로 결합합니다.

(B) PROTAC 분해제 설계를 위한 Exit Vector 제안:

• Exit Vector: "Exit vector"는 PROTAC 분해제를 설계할 때, 리간드와 목표 단백질이 결합한 후, 리간드의 나머지 부분을 어디에 위치시킬지 결정하는 방향성을 의미합니다. BI-7273의 구조에서 디메틸아민 그룹이 노출된 위치는 PROTAC 설계에서 세레블론 리간드를 연결할 이상적인 위치로 제안됩니다.
• PROTAC 설계: 이 위치를 활용하여, 연구진은 BRD9 단백질에 결합한 후, cerebron 리간드를 통해 E3 유비퀴틴 리가아제를 결합시키고, 이로 인해 BRD9이 분해되도록 설계된 PROTAC을 개발할 수 있었습니다. 이 과정에서 링커 길이와 조성은 분해 효율성, 선택성, 그리고 약물동태학에 중요한 역할을 하게 됩니다.

이러한 구조적 정보는 새로운 PROTAC 분해제를 설계하는 데 있어 매우 중요합니다. 특히, 어떤 부분에 세레블론 리간드를 연결해야 하는지, 그리고 그 연결이 BRD9과의 결합에 어떤 영향을 미치는지에 대한 이해를 하는데 도움이 됩니다 .

 

Table 2에서는 TX-11-Me (12)와 BI-7273 (3)를 기반으로 한 BRD9 PROTAC 분해제의 설계와 그 결과를 보여줍니다. 이 테이블은 다양한 링커를 사용하여 합성된 화합물들의 BRD9 분해 효능을 평가한 데이터를 포함하고 있습니다.

주요 내용 및 구조-활성 관계 (SAR) 분석:

1. 기본 설계:
   • TX-11-Me는 세레블론(CRBN) 리간드로 사용되었고, BI-7273는 BRD9에 선택적으로 결합하는 억제제로 사용되었습니다.
   • 이 두 분자를 직접 연결하거나, 다양한 길이와 구조의 링커를 사용하여 연결하여 PROTAC 분해제를 설계했습니다.
2. 화합물 15:
   • 링커 없이 TX-11-Me와 BI-7273을 직접 연결하여 합성된 화합물. - 직접 연결 구조 이용 가능성 확인 
   • DC50: 37 nM, Dmax: 90%로, BRD9을 상당히 효과적으로 분해할 수 있었으나, 최고 효능은 기존의 dBRD9보다 낮았습니다.
3. 화합물 16-18:
   • 이들 화합물은 구조적 제한이 있는 링커(azetidine, piperidine, spiro)를 사용하여 합성되었습니다.
   • 화합물 18 (spiro 링커 사용)은 가장 높은 효능을 보였으며, DC50: 12.9 nM, Dmax: 99%로 나타났습니다. 이는 기존의 dBRD9보다 3배 더 높은 활성을 가집니다.
   • 이러한 결과는 링커의 구조와 제약이 PROTAC 분해제의 효능에 큰 영향을 미친다는 것을 보여줍니다.
4. 구조-활성 관계 (SAR) 분석: 이 부분이 정말 중요한 부분으로 경구화 가능한 구조를 만들 수 있느냐 없느냐의 갈림길입니다. 개인적으로 분자량과 PSA의 값을 최적화 하는 것이 중요합니다. 분자량은 800을 넘으면 안됩니다. 
   • 링커 구조: 링커의 유연성 또는 강성이 BRD9의 분해 효능에 직접적인 영향을 미칩니다. 예를 들어, 강성이 높은 spiro 구조는 BRD9 단백질과의 적절한 결합을 유도하여 더 높은 효능을 나타냈습니다.
   • 분자 크기 및 극성: 화합물 18은 분자량 716, polar surface area (tPSA) 124 Ų, logP 값 2.3으로, 이는 적절한 경구 생체이용률을 가질 가능성을 시사합니다.
   • 링커의 최적화는 PROTAC의 효능, 선택성, 약동학적 특성에 중요하며, 구조의 세밀한 조정이 필요합니다.

이 테이블의 결과는 PROTAC 설계 시 링커의 길이와 구조가 BRD9 분해 효능에 미치는 영향을 잘 보여주며, 향후 최적화 작업에 중요한 기초 데이터를 제공합니다 .

 

Table 3는 대표적인 BRD9 분해제들의 경구 노출 및 대사 안정성 데이터를 요약한 표입니다. 이 표는 개발된 화합물들의 경구 투여 후 혈장 내 농도와 각 화합물의 대사 안정성을 평가합니다. 여기에서 설명된 화합물들은 CW-3185, CW-3235, CW-3231, CW-3233, CW-3232로, 이들은 각각 다른 링커 구조를 가진 BRD9 PROTAC 분해제들입니다.

주요 내용:

1. 혈장 농도:
   • 각 화합물은 10 mg/kg의 용량으로 경구 투여되었으며, 투여 후 1시간, 3시간, 6시간 후의 혈장 농도가 측정되었습니다.
   • CW-3232 (화합물 26)은 1시간 및 3시간 후 각각 193 ng/mL 및 204 ng/mL의 높은 혈장 농도를 보여, 다른 화합물들보다 훨씬 높은 경구 생체이용률을 나타냈습니다. 6시간 후에도 32 ng/mL로 비교적 높은 농도를 유지했습니다.
   • 다른 화합물들(예: CW-3185, CW-3231)은 혈장 농도가 <5 ng/mL로 매우 낮아, 경구 투여 후 체내에서 잘 흡수되지 않거나 대사에 의해 빠르게 분해되는 것으로 보입니다.
2. 대사 안정성:
   • 각 화합물의 대사 안정성은 마우스, 쥐, 인간의 간 미세소체에서 측정되었습니다.
   • CW-3231 (화합물 23)은 60분 이상의 반감기를 보여 매우 안정적인 대사 프로필을 나타냈습니다.
   • 반면, CW-3235 (화합물 20)은 마우스, 쥐, 인간 간 미세소체 모두에서 10분 미만의 매우 짧은 반감기를 나타내어 대사적으로 불안정한 특성을 보였습니다.
   • CW-3232는 마우스에서 44분, 인간에서 59분의 반감기를 보여 상대적으로 안정적이었으나, 다른 화합물에 비해 약간 낮은 안정성을 나타냈습니다.

구조-활성 관계 (SAR) 분석:

• 링커의 길이와 구조가 화합물의 경구 노출과 대사 안정성에 중요한 역할을 합니다.
  • CW-3232는 [6,6] 스피로 링커(spiro linker)를 포함하고 있어, 가장 높은 혈장 농도를 유지하며 경구 생체이용률이 우수했습니다.
  • CW-3231은 구조적으로 유사하지만 더 긴 링커를 포함하며, 이로 인해 높은 대사 안정성을 유지하면서도 경구 투여 시 낮은 혈장 농도를 나타냈습니다.
  • CW-3235의 낮은 안정성은 링커 구조가 너무 유연하거나 적절한 위치에서 분해를 유발할 가능성이 있습니다.

이 결과들은 화합물의 링커 설계가 약물의 체내 흡수, 분포, 대사 및 배설(ADME) 특성에 큰 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 추가적인 최적화가 필요하며, 이러한 데이터를 바탕으로 구조를 조정하여 더 나은 경구 투여 약물 후보를 개발할 수 있을 것입니다​.

 

 

Table 4에서는 Compound 18을 기반으로 링커 구조를 고정화(rigidification)하여 BRD9 PROTAC 분해제의 효능과 ADME(흡수, 분포, 대사, 배설) 특성을 개선한 연구 결과입니다. 이 표는 다양한 링커를 사용하여 합성된 화합물들의 BRD9 분해 효능과 약동학적 특성을 평가한 데이터를 보여줍니다.

주요 내용 및 구조-활성 관계 (SAR) 분석:

1. 배경:
   • Compound 18은 [6,4] spiro 링커를 포함하며, BRD9 분해제 설계의 초기 단계에서 가장 강력한 효능을 보인 화합물입니다. 그러나, 이 화합물은 체내에서 높은 분포 용적과 높은 클리어런스(제거율)를 보였고, 이로 인해 경구 투여 후 낮은 혈장 농도를 나타냈습니다.
   • 이러한 문제를 해결하기 위해, 연구진은 링커의 구조를 고정화하여 화합물의 효능과 약동학적 특성을 개선하려 했습니다.
2. 링커 고정화에 따른 화합물 성능:
   • Compound 19: [6,6] spiro 링커와 아미드 결합을 도입한 화합물로, DC50 값이 3 nM으로 매우 높은 BRD9 분해 효능을 나타냈습니다. 이는 링커의 고정화가 효능을 크게 개선할 수 있음을 보여줍니다.
   • Compound 20: 이 화합물은 DC50 = 4.4 nM의 뛰어난 BRD9 분해 효능을 가지고 있으며, 분자량이 상대적으로 낮고, **polar surface area (PSA)**가 141 Ų로 적절한 경구 생체이용률을 기대할 수 있습니다. 그러나, 대사 안정성이 낮아 경구 투여 후 낮은 혈장 노출도를 보였습니다.
   • Compound 21 및 22: 추가적인 고정화 링커 구조를 도입한 화합물로, 각각 DC50 = 7 nM과 11 nM의 효능을 보였습니다. 그러나, 전반적인 효능은 Compound 19와 20에 비해 약간 낮았습니다.
3. 구조-활성 관계 (SAR) 분석:
   • spiro linker 를 사용한 링커 고정화는 화합물의 BRD9 분해 효능을 크게 향상시키며, 특히 Compound 19에서 높은 효능 개선이 확인되었습니다. 링커가 유연하면 효능이 감소할 수 있으며, 이는 목표 단백질과의 결합 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다.
   • 아미드 결합 도입: 아미드 결합의 도입은 효능을 향상시킬 뿐만 아니라, 분자의 물리적, 화학적 안정성을 개선하여 대사 안정성에도 긍정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
   • 분자 크기와 극성: 분자량이 적절하면서도 극성이 높은 화합물들은 더 나은 약물동태학적 특성을 보입니다. Compound 20의 낮은 혈장 노출도는 높은 극성(PSA 141 Ų)과 대사 불안정성에 기인할 수 있습니다.

이 결과들은 PROTAC 설계에서 링커의 구조적 고정화가 화합물의 효능과 ADME 특성에 중요한 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 추가적인 최적화를 통해 더 나은 약물 후보를 개발할 수 있으며, 특히 경구 생체이용률과 대사 안정성의 균형이 중요한 역할을 합니다​.

 

 

 

Table 5에서는 Compound 26의 억제제 부분을 최적화한 내용입니다. 이 표는 BRD9 단백질의 분해 능력을 극대화하기 위해 BI-7273의 구조를 어떻게 변경했는지 설명하고, 각 구조 변형이 화합물의 효능에 미치는 영향을 보여줍니다.

주요 내용 및 SAR(구조-활성 관계) 분석:

1. N-메틸 그룹 변형:
   • Compound 27: Compound 26의 N-메틸 그룹을 N-에틸로 변경하여 합성. 이 화합물은 DC50 = 92 nM 및 **Dmax = 99%**로, Compound 26보다 효능이 약간 떨어졌습니다.
   • Compound 28: N-프로필 그룹으로 변경한 화합물로, DC50 = 372 nM으로 효능이 크게 감소했습니다.
   • Compound 29: N-부틸 그룹으로 변경하여 합성되었으며, DC50 = 186 nM으로 Compound 28보다 효능이 개선되었으나 여전히 Compound 26보다는 낮은 효능을 보였습니다.
2. 피리딘 링의 변형:
   • Compound 32: Compound 26의 피리딘 링에 6-메틸을 추가한 화합물로, DC50 = 84 nM 및 Dmax = 98% 로, 효능이 약간 감소했습니다.
   • Compound 34-36: 6-메틸 그룹을 에틸, 이소프로필, 시클로프로필로 변경한 화합물들은 모두 효능이 더 낮았습니다.
3. 피리딘 링의 전자적 특성 변경:
   • Compound 37: 6-메틸을 아제티딘으로 대체하여 합성. DC50 = 70 nM 및 Dmax = 99%로 높은 효능을 유지했습니다.

구조-활성 관계 (SAR) 분석:

• N-알킬 그룹의 변화는 효능에 직접적인 영향을 미쳤습니다. N-메틸을 유지한 경우(Compound 26)가 가장 높은 효능을 나타냈으며, N-에틸이나 N-프로필로 변경할수록 효능이 감소했습니다.
• 피리딘 링의 변형 또한 효능에 중요한 영향을 미쳤습니다. 6-메틸을 추가하거나 다른 그룹으로 대체하는 것은 효능을 약간 감소시키는 결과를 낳았습니다. 그러나, 아제티딘 그룹의 도입은 오히려 효능을 유지하거나 개선하는 데 도움이 되었습니다.
• 최적화 전략으로 볼 때, 원래의 N-메틸 그룹과 피리딘 링의 기본 구조를 유지하면서, 링의 전자적 특성을 약간 변경하는 것이 효능을 유지하는 데 중요하다는 것을 알 수 있습니다.

이 표의 결과는 BRD9 억제제 부분의 구조적 수정이 효능에 어떻게 영향을 미치는지를 명확히 보여주며, PROTAC 설계에서 적절한 구조 최적화의 중요성을 강조합니다 .

 

 

Table 6는 세 가지 대표적인 BRD9 분해제의 쥐에서의 경구 노출 데이터입니다. 이 데이터는 각 화합물의 경구 투여 후 혈장 내 약물 농도를 시간에 따라 평가한 것입니다. 여기에는 Compound 27 (CW-3308), Compound 29 (CW-5011), 그리고 Compound 37 (CW-5292)의 농도 프로필이 포함됩니다.

주요 내용 및 SAR(구조-활성 관계) 분석:

1. Compound 27 (CW-3308):
   • 경구 투여(10 mg/kg) 후 1시간 내에 5,290 ng/mL의 높은 혈장 농도를 달성했습니다.
   • 3시간 후 농도는 1,350 ng/mL로 감소했고, 6시간 후에는 48.6 ng/mL로 급격히 감소했습니다.
   • 이 화합물은 높은 초기 농도를 나타내지만 빠르게 소실되며, 이는 매우 효과적인 초기 노출을 시사합니다.
2. Compound 29 (CW-5011):
   • 5 mg/kg의 용량으로 경구 투여했을 때, 1시간 후 668 ng/mL, 3시간 후 530 ng/mL, 6시간 후 368 ng/mL의 농도를 기록했습니다.
   • 24시간 후에도 17.6 ng/mL의 낮은 농도가 유지되었습니다.
   • 이는 비교적 안정적인 노출 프로필을 보여, 시간에 따라 서서히 감소하는 특징을 보입니다.
3. Compound 37 (CW-5292):
   • 이 화합물은 경구 투여 후 1 ng/mL 미만의 혈장 농도만을 기록하여, 거의 경구 생체이용률이 없음을 나타냅니다.
   • 이는 경구 투여에 적합하지 않은 화합물임을 시사하며, 추가적인 구조 수정이 필요합니다.

구조-활성 관계 (SAR) 분석:

• 링커 구조와 약물 농도: CW-3308과 CW-5011은 비슷한 구조적 특징을 가지고 있으나, CW-3308이 초기 농도가 훨씬 높게 나타났습니다. 이는 CW-3308의 구조가 경구 흡수율을 크게 향상시킨 결과일 수 있습니다.
• 구조적 불안정성: CW-5292의 매우 낮은 농도는 이 화합물이 구조적으로 불안정하거나, 경구 투여 시 대사되어 소실될 가능성이 높다는 것을 보여줍니다.

이 표의 결과는 BRD9 분해제 설계에서 구조적 요소가 경구 생체이용률에 어떻게 영향을 미치는지 명확히 보여줍니다. 특히, CW-3308은 경구 투여 후 높은 초기 농도를 유지하므로, 추가적인 연구를 통해 더욱 최적화된 경구 약물로 발전시킬 가능성이 있습니다​.

 

Table 7는 Compound 27 (CW-3308)의 대사 안정성 및 혈장 안정성을 다룹니다. 이 표는 마우스, 쥐, 인간에서의 간 미세소체와 혈장에서 화합물의 반감기를 측정한 결과를 보여줍니다.

주요 내용:

1. 대사 안정성:
   • CW-3308은 마우스, 쥐, 인간 모두에서 >60분의 반감기를 기록했습니다. 이는 이 화합물이 간 미세소체에서 매우 안정적이라는 것을 의미하며, 체내에서 빠르게 대사되지 않음을 시사합니다.
2. 혈장 안정성:
   • 마찬가지로, CW-3308은 마우스, 쥐, 인간의 혈장에서 >60분의 반감기를 보였습니다. 이는 CW-3308이 혈장에서 안정적으로 존재할 수 있음을 나타내며, 체내 순환에서 약물이 충분한 시간 동안 활성을 유지할 수 있음을 의미합니다.

구조-활성 관계 (SAR) 분석:

• 대사 안정성: CW-3308의 구조적 특성은 간 미세소체에서 높은 안정성을 유지할 수 있게 합니다. 이 화합물의 구조적 요소들이 대사 효소로부터의 분해를 방지하고 있음을 보여줍니다.
• 혈장 안정성: CW-3308은 혈장에서도 매우 안정적인데, 이는 경구 투여 후에도 장시간 동안 활성 상태로 남아 있을 수 있는 가능성을 높입니다.

이 표의 데이터는 CW-3308이 다양한 생체 내 환경에서 매우 안정적이라는 것을 강조하며, 경구 투여 가능성을 가진 강력한 BRD9 분해제로서의 가능성을 보여줍니다 .

 

Table 8는 쥐에서 Compound 27 (CW-3308)의 정맥 주사(IV)와 경구 투여(PO) 후의 약물 동태학적(PK) 매개변수를 나타냅니다. 이 데이터를 통해 CW-3308의 체내 분포, 대사, 배설과 관련된 중요한 정보들을 알 수 있습니다.

주요 내용:

1. IV(정맥 주사) 경로:
   • Cmax (최대 혈장 농도): 991 ng/mL
   • AUC (0-24h): 48 h·ng/mL
   • t1/2 (반감기): 18.2시간
   • CL (청소율): 91 mL/min/kg
   • Vss (정상 상태에서의 분포 용적): 18.2 L/kg
   • %F (경구 생체이용률): IV 경로에서는 경구 생체이용률이 측정되지 않지만, 정맥 주사를 통해 높은 농도에서 빠르게 혈중에 도달함을 의미합니다.
2. PO(경구 투여) 경로:
   • Cmax (최대 혈장 농도): 172 ng/mL
   • AUC (0-24h): 1499 h·ng/mL
   • t1/2 (반감기): 3.7시간
   • %F (경구 생체이용률): 91%
   • 경구 투여 후에도 CW-3308은 비교적 높은 생체이용률(91%)을 보이며, 이는 약물이 경구 투여 후에도 효과적으로 체내에 흡수되어 작용할 수 있음을 나타냅니다.

SAR(구조-활성 관계) 분석:

• 분포와 청소율: CW-3308의 높은 분포 용적과 청소율은 약물이 체내에서 넓게 분포하며, 상대적으로 빠르게 대사됨을 의미합니다. 이는 주로 약물의 구조적 특성에서 기인할 수 있으며, 약물이 체내에서 빠르게 작용하지만 빠르게 소실될 가능성도 있습니다.
• 경구 생체이용률: CW-3308은 경구 투여 후에도 높은 생체이용률을 나타내어, 경구 투여 시 효과적으로 흡수될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이는 약물의 화학적 안정성과 체내 대사 저항성을 반영합니다.

이 데이터는 CW-3308이 정맥 주사뿐만 아니라 경구 투여에서도 효과적으로 작용할 수 있음을 보여주며, 특히 경구 생체이용률이 높다는 점에서 약물 개발에 유리한 특성을 가지고 있음을 시사합니다​

 

 

Figure 4는 Western blotting을 사용하여 BRD9, BRD7, BRD4 단백질의 분해를 분석한 결과를 보여줍니다. 실험은 G401 세포주에서 진행되었으며, BRD9을 타겟으로 하는 여러 PROTAC 분해제(예: dBRD9, Compound 18, 19, 42, 27)를 3시간 동안 처리한 후, 단백질 수준을 평가했습니다. β-actin은 로딩 컨트롤로 사용되어 각 샘플의 단백질 로딩이 균일한지를 확인합니다.

주요 내용:

1. 실험 설정:
   • G401 세포주: 이 세포주는 악성 라브도이드 종양의 세포주로, BRD9 단백질이 중요한 역할을 합니다.
   • 처리된 화합물: dBRD9, Compound 18, 19, 42, 27는 BRD9을 표적으로 설계된 PROTAC 분해제입니다. 이들 화합물의 효능을 비교하여 BRD9 단백질의 분해 정도를 평가합니다.
2. Western Blotting 결과:
   • BRD9 단백질:
     • Compound 19와 27: BRD9 단백질을 매우 효과적으로 분해했습니다. 특히, 1 nM 농도에서 BRD9 단백질 수준을 68% 감소시켰습니다.
     • dBRD9: 비교적 강력한 분해제를 나타내지만, Compound 19와 27에 비해 효능이 약간 낮았습니다.
     • Compound 18: HiBit 분석에서 강력한 효능을 보였으나, Western blotting 분석에서는 Compound 27보다 약간 낮은 효능을 보였습니다.
     • Compound 42: 다른 화합물들에 비해 BRD9 분해 효능이 현저히 낮았습니다.
   • BRD7 및 BRD4 단백질:
     • 모든 화합물은 BRD7 및 BRD4 단백질에 거의 영향을 미치지 않았습니다. 이는 이들 화합물이 BRD9에 대해 매우 선택적인 분해를 유도함을 의미합니다.
3. 데이터 해석 및 배경 지식:
   • PROTAC 기술: PROTAC(Proteolysis Targeting Chimera) 기술은 특정 단백질을 표적으로 하여 선택적으로 분해하는 합성 분자입니다. 이 기술은 E3 유비퀴틴 리가아제와 목표 단백질을 동시에 결합시켜, 목표 단백질이 유비퀴틴화되고 프로테아좀에 의해 분해되도록 유도합니다.
   • Western blotting: 이 기술은 단백질의 존재 여부와 양을 확인하는 실험 방법입니다. 실험에서 검출된 밴드의 강도는 단백질의 양을 나타내며, 특정 단백질의 분해 정도를 정량적으로 평가하는 데 사용됩니다.

결론:

• Compound 19와 27은 BRD9 단백질을 매우 효과적으로 분해하며, 다른 관련 단백질(BRD7, BRD4)에는 거의 영향을 미치지 않으므로, BRD9에 대한 높은 선택성을 가진 강력한 분해제로 평가됩니다.
• dBRD9도 유의미한 분해 효능을 보였지만, 최신 화합물들에 비해 약간의 차이가 있습니다.
• Compound 42는 BRD9 분해에 비효과적이므로, 구조적 최적화가 필요할 수 있습니다.

이 결과는 BRD9 타겟팅 PROTAC 분해제의 설계 및 개발에 중요한 정보를 제공하며, 특히 Compound 27의 강력한 효능은 추가적인 연구와 개발의 가능성을 시사합니다.

 

 

Figure 5는 HS-SY-II 세포주에서 다양한 농도의 BRD9 분해제를 처리한 후, BRD9 단백질의 농도 의존적인 분해를 Western blotting을 통해 분석한 결과를 보여줍니다. 이 실험에서는 dBRD9, Compound 18, 19, 27이 사용되었으며, 각 화합물의 효능을 비교 평가하기 위해 여러 농도로 3시간 동안 처리되었습니다. β-actin은 로딩 컨트롤로 사용되어 각 샘플에서의 단백질 로딩이 균일한지 확인합니다.

주요 내용:

1. 실험 설정:
   • HS-SY-II 세포주: 이 세포주는 활막육종과 관련된 세포주로, BRD9 단백질이 이 암의 생존과 성장에 중요한 역할을 합니다.
   • 처리된 화합물: dBRD9, Compound 18, 19, 27은 모두 BRD9을 표적으로 하는 PROTAC 분해제입니다.
2. Western Blotting 결과:
   • BRD9 단백질:
     • Compound 19와 27: 두 화합물 모두 농도 의존적으로 BRD9 단백질을 매우 효과적으로 분해했습니다. 특히, 10 nM 농도에서 BRD9 단백질 수준을 70% 이상 감소시켰고, 100 nM에서는 98% 이상 감소시켰습니다.
     • dBRD9: BRD9 단백질을 분해하는 데 유효했으나, 같은 농도에서 Compound 19와 27보다 약간 낮은 효능을 보였습니다.
     • Compound 18: 이 화합물도 BRD9을 분해했지만, Western blotting 결과에서는 Compound 19와 27보다 약간 낮은 효능을 보였습니다.
   • 농도 의존성:
     • 모든 화합물은 농도가 증가함에 따라 BRD9 단백질의 분해 효능이 증가했습니다. 이는 각 화합물이 BRD9에 대해 농도 의존적인 반응을 보이며, 일정 농도 이상에서 최적의 분해 효과를 나타내는 것을 의미합니다.

데이터 해석 및 배경 지식:

1. PROTAC 기술:
   • PROTAC(Proteolysis Targeting Chimera) 기술은 목표 단백질과 E3 유비퀴틴 리가아제를 동시에 결합시켜 목표 단백질이 유비퀴틴화되고 프로테아좀에 의해 분해되도록 유도하는 합성 분자입니다.
   • 이 기술의 강점은 목표 단백질을 선택적으로 분해할 수 있다는 점이며, 이는 표적 단백질을 억제하는 기존의 소분자 억제제와 비교해 훨씬 강력한 효과를 발휘할 수 있습니다.
2. Western Blotting:
   • Western blotting은 특정 단백질의 존재 여부와 양을 확인하는 실험 방법입니다. 밴드의 강도는 단백질의 양을 나타내며, 특정 단백질의 분해 정도를 정량적으로 평가할 수 있습니다.
   • 농도 의존적 효과는 화합물이 특정 농도에서 목표 단백질에 얼마나 강하게 결합하여 분해를 유도할 수 있는지를 보여줍니다.

결론:

• Compound 19와 27은 BRD9 단백질에 대해 매우 강력한 분해 효능을 나타내며, 특히 높은 농도에서 거의 완전한 단백질 분해를 유도했습니다. 이는 이들 화합물이 매우 효과적인 BRD9 타겟팅 PROTAC 분해제임을 강력하게 시사합니다.
• dBRD9도 유의미한 분해 효과를 나타냈지만, 최신 화합물들에 비해 약간의 차이가 있음을 알 수 있습니다.
• Compound 18은 여전히 강력한 효능을 보였지만, Compound 19와 27에 비해 효능이 다소 낮았습니다.

이 결과는 BRD9 타겟팅 PROTAC 분해제의 효능을 비교하고, 가장 효과적인 후보를 도출하는 데 중요한 정보를 제공합니다. 특히 Compound 27은 추가적인 개발과 최적화를 통해 강력한 치료제가 될 가능성이 큽니다.

 

 

Figure 6는 CW-3308이 G401 세포에서 BRD9 단백질을 분해하는 속도와 기전을 분석한 결과입니다. 이 그림은 두 부분으로 나뉘어 있으며, (A)에서는 시간에 따른 BRD9 분해 속도를, (B)에서는 CW-3308의 작용 메커니즘을 조사합니다.

(A) BRD9 분해 속도 분석

1. 실험 설정:
   • G401 세포에 100 nM 농도의 CW-3308을 처리한 후, 다양한 시간대에 BRD9 단백질 수준을 Western blotting으로 측정했습니다.
2. 결과 해석:
   • 1시간: CW-3308 처리 후 1시간 이내에 BRD9 단백질 수준이 크게 감소하기 시작했습니다.
   • 3시간: 3시간 후에는 BRD9 단백질의 농도가 거의 최대 수준으로 감소했습니다.
   • 6시간: 6시간이 지나면서 BRD9 단백질이 거의 완전히 분해되었음을 확인할 수 있습니다.
   • 결론: CW-3308은 BRD9 단백질을 매우 빠르게 분해하며, 3시간 이내에 효과적으로 작용하기 시작하여 6시간 내에 거의 모든 BRD9 단백질을 제거합니다.

(B) BRD9 분해 기전 분석

1. 실험 설정:
   • G401 세포에 다음과 같은 조건으로 화합물을 처리한 후 BRD9 단백질 수준을 Western blotting으로 분석했습니다:
     • CW-3308 (100 nM): 단독 처리
     • BI-7273 (10 μM): BRD9 억제제 단독 처리
     • 레날리도마이드 (10 μM): 세레블론 리간드 단독 처리
     • CW-3308 + BI-7273: CW-3308과 BRD9 억제제의 병용 처리
     • CW-3308 + 레날리도마이드: CW-3308과 세레블론 리간드의 병용 처리
2. 결과 해석:
   • CW-3308 단독 처리: BRD9 단백질 수준이 크게 감소하여, CW-3308이 BRD9 단백질을 효과적으로 분해함을 확인할 수 있습니다.
   • BI-7273 단독 처리: BRD9 단백질 수준이 줄어들지 않아, BI-7273이 BRD9을 억제하지만 분해시키지는 못함을 나타냅니다.
   • 레날리도마이드 단독 처리: 세레블론 리간드인 레날리도마이드는 BRD9에 영향을 미치지 않아, BRD9 단백질 수준이 유지됩니다.
   • CW-3308 + BI-7273: BRD9 단백질 수준이 여전히 크게 감소하므로, BI-7273이 CW-3308의 BRD9 분해 기능을 억제하지 않음을 알 수 있습니다.
   • CW-3308 + 레날리도마이드: BRD9 단백질 수준이 감소하지 않음을 확인할 수 있습니다. 이는 세레블론 리간드인 레날리도마이드가 CW-3308과 경쟁하여 세레블론에 결합하고, CW-3308이 세레블론과 결합하지 못하게 하여 BRD9의 분해가 억제된다는 것을 의미합니다.

데이터 해석을 위한 배경 지식:

1. PROTAC의 기전:
   • PROTAC은 목표 단백질(BRD9)과 E3 유비퀴틴 리가아제(CRBN)를 동시에 결합시켜, 목표 단백질을 유비퀴틴화하여 프로테아좀에 의해 분해되도록 유도합니다. 여기서 CW-3308은 BRD9을 표적으로 하여, CRBN을 통해 분해를 유도하는 역할을 합니다.
   • BI-7273은 BRD9을 억제할 수는 있지만, 분해시키지는 못합니다. 반면, 레날리도마이드는 CRBN에 결합하는 리간드로, CW-3308과 경쟁하여 BRD9의 분해를 방해할 수 있습니다.
2. Western blotting:
   • 이 기술을 통해 특정 단백질의 농도를 시각적으로 확인할 수 있습니다. 실험에서 나타난 밴드의 강도는 단백질의 양을 나타내며, 밴드가 희미해질수록 단백질이 분해되었음을 의미합니다.

결론:

• CW-3308은 BRD9을 빠르고 효과적으로 분해하며, 3시간 내에 거의 완전한 분해를 유도할 수 있습니다.
• BI-7273는 CW-3308의 BRD9 분해 활동에 영향을 미치지 않지만, 레날리도마이드는 CW-3308과 CRBN 간의 결합을 경쟁적으로 방해하여 BRD9 분해를 억제할 수 있습니다.
• 이 결과는 CW-3308이 BRD9 타겟팅 PROTAC으로서 매우 유망한 후보임을 보여주며, 레날리도마이드와 같은 세레블론 리간드가 존재할 때 그 기전이 어떻게 영향을 받을 수 있는지를 설명합니다.

 

Figure 7는 CW-3308의 BRD9 및 BRD4 단백질에 대한 결합 친화도를 평가한 결과를 보여줍니다. 이 분석에서는 BI-7273과 JQ-1을 참조 화합물로 사용하여 비교했습니다.

(A) BRD9 단백질에 대한 결합 친화도:

• CW-3308의 BRD9에 대한 IC50 값은 5.0 nM으로, 매우 높은 결합 친화도를 나타냅니다.
• BI-7273도 BRD9에 대해 유사한 수준의 결합 친화도(7.2 nM)를 보입니다.
• 이는 CW-3308이 BRD9에 대해 매우 강력한 결합 능력을 가지고 있음을 의미합니다.

(B) BRD4 단백질에 대한 결합 친화도:

• CW-3308과 BI-7273은 모두 BRD4에 대해 거의 결합하지 않으며, 10 μM 농도에서도 결합이 관찰되지 않았습니다.
• 반면 JQ-1은 BRD4에 대해 129 nM의 IC50 값을 보여 강력한 결합을 나타내지만, BRD9에 대해서는 결합하지 않았습니다.

데이터 해석 및 배경 지식:

• PROTAC 기술에서 목표 단백질에 대한 높은 선택성과 결합 친화도는 중요한 요소입니다. CW-3308은 BRD9에 강력하게 결합하면서도 BRD4와 같은 관련 단백질에 결합하지 않기 때문에, BRD9에 대한 높은 선택성을 유지할 수 있습니다.
• 참조 화합물인 BI-7273과 JQ-1은 각각 BRD9과 BRD4에 특이적으로 결합하는데, CW-3308의 결합 프로필은 이들 두 단백질에 대한 차별적 결합을 확실히 보여줍니다 .

 

Table 9에서는 CW-3308의 세포 배양 배지에서의 안정성을 평가한 결과를 보여줍니다. 이 표는 CW-3308이 다양한 시간대에 걸쳐 얼마나 안정적으로 남아 있는지를 분석한 데이터를 포함하고 있습니다.

주요 내용:

• 0시간: CW-3308의 농도를 100%로 설정하여 시작했습니다.
• 1시간: 1시간 후, CW-3308의 약 35.9%만이 배지에서 안정적으로 남아 있음을 확인했습니다.
• 3시간: 3시간 후에는 CW-3308의 15.2%만이 남아 있었으며, 이는 배지에서 상당한 분해가 일어났음을 시사합니다.
• 6시간: 6시간 후에는 CW-3308의 3.1%만이 남아 있어, 거의 대부분이 분해되었음을 나타냅니다.
• 24시간 및 48시간: CW-3308은 시간이 지남에 따라 안정성이 더욱 낮아져 24시간 후에는 1.2%, 48시간 후에는 0.6%만이 남아 있었습니다.

데이터 해석 및 배경지식:

• 세포 배양 배지에서의 안정성은 약물이 세포 환경에서 얼마나 오래 유지될 수 있는지를 평가하는 중요한 지표입니다. CW-3308은 세포 배양 배지에서 상대적으로 불안정하여, 짧은 시간 내에 대부분이 분해된다는 점이 확인되었습니다.
• 그러나, 비록 CW-3308이 배지에서 불안정하더라도, 이 화합물은 여전히 세포 내에서 BRD9 단백질을 효과적으로 분해할 수 있습니다. 이는 PROTAC 기술이 짧은 시간 동안만 목표 단백질에 결합하더라도, 강력한 분해 효과를 발휘할 수 있음을 의미합니다 .

 

Figure 8는 CW-3308, BI-7273, 및 레날리도마이드가 G401 및 HS-SY-II 세포주에서 세포 생존율에 미치는 영향을 분석한 결과를 보여줍니다. 이 실험에서는 각 화합물을 다양한 농도로 처리한 후 4일 동안 세포 생존율을 측정했습니다. CellTiter-Glo 분석을 사용하여 세포 생존율을 평가했습니다.

(A) G401 세포주에서의 결과:

• CW-3308은 IC50 = 185 nM로, 매우 강력한 세포 생존 억제 효과를 보였습니다. 최대 억제율(Imax)은 90%로, G401 세포에서 높은 활성을 나타냅니다.
• BI-7273은 IC50 = 4.9 μM로, CW-3308에 비해 약 26배 낮은 활성을 보였습니다. 최대 억제율(Imax)은 67%로, CW-3308보다 현저히 낮았습니다.
• 레날리도마이드는 10 μM에서 최대 억제율 42%로, 상대적으로 미미한 효과를 보였습니다.

(B) HS-SY-II 세포주에서의 결과:

• CW-3308은 IC50 = 2.7 μM로, HS-SY-II 세포에서도 강력한 억제 효과를 나타냈으며, 최대 억제율(Imax)은 94%였습니다.
• BI-7273 및 레날리도마이드는 10 μM 농도에서도 23% 이하의 낮은 억제율을 보여, 이 세포주에서는 효과가 거의 없었습니다.

데이터 해석 및 배경 지식:

• CellTiter-Glo 분석은 세포의 생존율을 ATP 수준으로 평가하는 실험 방법으로, 살아있는 세포가 발현하는 ATP의 양을 통해 세포 생존력을 간접적으로 측정합니다.
• CW-3308은 BRD9을 표적으로 하는 강력한 PROTAC 분해제로, 두 세포주(G401과 HS-SY-II) 모두에서 BI-7273보다 훨씬 강력한 세포 성장 억제 효과를 나타냈습니다.
• 레날리도마이드는 세레블론 리간드로서의 역할을 하며, 이 실험에서는 비교적 낮은 효과를 보였지만, CW-3308의 효능 평가에서 중요한 참조 화합물로 사용되었습니다.

이 결과는 CW-3308이 BRD9 의존적인 종양에서 강력한 항암 활성을 가지고 있으며, 특히 기존의 BRD9 억제제보다 훨씬 우수한 효능을 가지고 있음을 시사합니다 .

 

 

Figure 9는 CW-3308의 약력학적(PD) 연구 및 약물 농도를 분석한 결과를 보여줍니다. 이 실험에서는 HS-SY-II 종양을 가진 마우스에게 50 mg/kg의 단일 경구 용량을 투여한 후, 3시간 및 24시간 후에 종양 조직을 수집하여 BRD9 단백질의 수준과 CW-3308의 혈장 및 종양 내 농도를 분석했습니다.

(A) BRD9 단백질 수준 분석 (Western blotting)

• 3시간 후: CW-3308을 경구 투여한 후 3시간째에 종양 조직에서 BRD9 단백질 수준이 크게 감소했습니다. Western blotting 결과, BRD9 단백질의 밴드가 눈에 띄게 감소하여, CW-3308이 종양 내 BRD9을 효과적으로 분해했음을 확인할 수 있습니다.
• 24시간 후: 24시간이 지난 후에도 BRD9 단백질 수준이 여전히 낮은 상태를 유지하고 있습니다. 이는 CW-3308이 체내에서 지속적으로 작용하여 장기적인 BRD9 분해 효과를 제공할 수 있음을 나타냅니다.
• β-Actin은 로딩 컨트롤로 사용되어, 각 샘플에서의 단백질 로딩이 균일한지 확인할 수 있습니다.

(B) CW-3308의 혈장 및 종양 내 농도

• 혈장 농도:
  • 3시간 후: CW-3308의 혈장 농도는 1360 ng/mL로, 약물이 체내에서 높은 농도로 존재함을 나타냅니다.
  • 24시간 후: 혈장 내 농도는 147 ng/mL로 감소했지만, 여전히 검출 가능한 수준입니다.
• 종양 내 농도:
  • 3시간 후: CW-3308의 종양 내 농도는 500 ng/mL로, 혈장보다 낮지만 여전히 유의미한 수준입니다.
  • 24시간 후: 종양 내 농도는 27 ng/mL로 감소했지만, CW-3308이 종양에 어느 정도 축적되어 작용하고 있음을 시사합니다.

데이터 해석 및 배경 지식:

• 약력학(PD) 연구는 약물이 체내에서 목표 단백질(BRD9)에 미치는 생리적 효과를 분석하는 실험입니다. 여기서는 BRD9 단백질의 분해 효과를 Western blotting으로 분석했습니다.
• 혈장 및 종양 농도는 약물이 체내에서 어떻게 분포되고 시간이 지나면서 어떻게 변화하는지를 나타냅니다. CW-3308은 경구 투여 후 체내에서 충분한 농도로 유지되며, 종양 조직에서도 유의미한 농도로 존재하여 효과적으로 작용하고 있음을 보여줍니다.

결론:

• CW-3308은 HS-SY-II 종양을 가진 마우스 모델에서 BRD9 단백질을 빠르게 그리고 지속적으로 분해하는 강력한 PROTAC 분해제로서의 가능성을 보여줍니다.
• 3시간과 24시간 후에도 BRD9 단백질 수준이 낮게 유지되는 것은 CW-3308의 긴 작용 시간을 나타내며, 이는 치료적으로 중요한 특성입니다.
• 혈장 및 종양 내 농도 데이터는 CW-3308이 경구 투여 후 체내에서 효과적으로 분포하고, 종양 내에서 지속적으로 농도를 유지하여 장기적인 효과를 발휘할 수 있음을 시사합니다.

이 데이터는 CW-3308이 BRD9을 표적으로 하는 치료제로서 높은 잠재력을 가지고 있음을 보여줍니다 .

 

Figure 10는 CW-3308의 항암 효능과 HS-SY-II 이종이식 모델에서의 마우스 체중 변화를 보여줍니다. 이 실험은 CW-3308의 효능을 평가하고, 치료 중 발생할 수 있는 독성을 관찰하기 위해 수행되었습니다.

(A) 항암 효능 분석

• 실험 설정: HS-SY-II 종양을 가진 마우스들에게 종양 크기가 평균 160 mm³에 도달했을 때, 50 mg/kg의 CW-3308을 경구로 투여했습니다. 투여는 5일 동안 매일 1회씩 4주간 이루어졌습니다. 대조군(비히클) 그룹은 6마리의 마우스, CW-3308 처리군은 각각 7마리의 마우스로 구성되었습니다.
• 결과: CW-3308을 투여한 그룹에서는 종양 성장이 현저하게 억제되었습니다. 종양 성장 억제율(TGI)은 25 mg/kg에서 57%, 50 mg/kg에서 60%에 달했습니다. 이는 CW-3308이 HS-SY-II 종양 모델에서 효과적인 항암 활성을 가지고 있음을 나타냅니다.

(B) 마우스 체중 변화

• 실험 설정: 항암 효능을 평가하는 동안 마우스의 체중 변화를 모니터링하여 CW-3308이 마우스에게 독성을 유발하는지 확인했습니다.
• 결과: CW-3308을 투여한 그룹과 비히클 그룹 모두에서 체중 변화는 거의 없었으며, 이는 CW-3308이 독성을 유발하지 않고 잘 내약성을 가지고 있음을 시사합니다.

데이터 해석 및 배경 지식

• 항암제 효능은 종양 크기의 감소 또는 성장이 억제되는 정도로 평가됩니다. 여기서 TGI(종양 성장 억제율)은 치료 전후의 종양 크기 변화를 통해 계산됩니다.
• 독성 평가는 항암 치료 중 마우스의 체중 변화를 통해 이루어집니다. 체중이 급격히 감소하면 약물의 독성이 의심될 수 있습니다.

결론:

• CW-3308은 HS-SY-II 종양 모델에서 유의미한 항암 효과를 나타냈으며, 마우스의 체중 변화가 거의 없었기 때문에 독성이 낮은 것으로 평가됩니다 .

 

Figure 11은 CW-3308이 BRD9과 **세레블론(CRBN)**과 함께 형성하는 삼중 복합체(ternary complex)에 대한 분자 역학 시뮬레이션 결과를 보여줍니다. 이 그림은 세 부분으로 나뉘어 있으며, 삼중 복합체의 개요, 상세한 결합 모델, 그리고 수소 결합 거리의 변화를 다룹니다.

(A) 삼중 복합체의 개요

• 구성 요소: 삼중 복합체는 BRD9(회색), CRBN(베이지색), CW-3308(녹색)으로 구성되어 있습니다. 이 구조는 200 ns 분자 역학 시뮬레이션을 통해 예측되었습니다.
• 기본 구조: CW-3308은 BRD9과 CRBN 사이에 위치하여 두 단백질을 연결합니다. CW-3308의 설계는 PROTAC 기술에 의해 이루어졌으며, 이 기술은 목표 단백질(BRD9)을 E3 유비퀴틴 리가아제(CRBN)와 연결하여 단백질을 분해하는 기능을 합니다.

(B) 삼중 복합체의 상세한 결합 모델

• 주요 결합 상호작용:
  • TYR357 (CRBN)의 하이드록실 그룹과 ILE53 (BRD9)의 백본 카보닐 사이에 형성된 수소 결합이 주목됩니다. 이 수소 결합은 삼중 복합체의 안정성에 중요한 역할을 합니다.
  • CW-3308은 BRD9의 활성 부위와 CRBN의 결합 부위에 동시에 결합하여 두 단백질이 가까이 위치하게 하고, 이로 인해 BRD9이 유비퀴틴화되어 분해될 수 있도록 합니다.
  • BRD9의 ZA 루프(ILE53 근처)가 CRBN의 TYR357과 상호작용하여 강력한 결합을 형성합니다. 이 상호작용은 CW-3308이 BRD9과 CRBN을 효과적으로 연결하는 데 필수적입니다.

(C) 수소 결합 거리의 변화

• 거리 변화 분석:
  • 수소와 산소 원자 간의 거리: CRBN의 TYR357과 BRD9의 ILE53 사이의 수소 결합 거리가 마지막 65 ns 동안 어떻게 변화했는지를 보여줍니다.
  • 평균 거리: 시뮬레이션에서 계산된 평균 거리는 2.8 Å로, 이는 매우 안정적인 수소 결합임을 시사합니다. 이러한 거리는 결합이 강력하고, 복합체가 물리적으로 안정함을 나타냅니다.
  • 거리의 변동성: 수소 결합 거리가 65 ns 동안 일정하게 유지되며 큰 변동이 없다는 것은 삼중 복합체가 시뮬레이션 기간 동안 구조적으로 안정적이었음을 의미합니다.

결론:

• CW-3308은 BRD9과 CRBN 사이의 강력한 상호작용을 매개하여 삼중 복합체를 형성하고, 이 과정에서 중요한 수소 결합이 형성되어 복합체의 안정성을 증가시킵니다.
• 분자 역학 시뮬레이션은 CW-3308이 BRD9과 CRBN을 효과적으로 연결하여 목표 단백질의 유비퀴틴화를 촉진하는 메커니즘을 잘 설명해줍니다.
• 이러한 결합 모델과 결합 상호작용은 CW-3308이 BRD9을 분해하는 데 있어 매우 효과적인 PROTAC 분해제임을 강력히 뒷받침합니다.